铁皮石斛叶片原生质体培养及离体根尖体细胞胚发生研究

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1、浙江大学硕士学位论文铁皮石斛叶片原生质体培养及离体根尖体细胞胚发生研究姓名：詹忠根申请学位级别：硕士专业：遗传学指导教师：张铭20030601摘要本研究论文之一是对铁皮石斛无菌试管苗的幼嫩叶片原生质体的游离及培养条件研究。结果表明原生质体分离的适宜酶液配比是O．5％Pectinase和1．O％cellulaseOnozukaR—lO；酶解时间为6h；渗透压调节剂的浓度为O．5M，以蔗糖作为渗透压调节剂优于甘露醇和葡萄糖，但是此时原生质体的产量下降28．7—38．1％；在酶液中添加150mg．L’1的抗坏血酸及20mg．L1的Cacl：可分别使原生质体的存活率提高9．2％

2、和15．7％；在酶解之前对材料进行质壁分离处理使原生质体的产量提高了3．23％，存活率提高了4．2％。叶肉原生质体培养，在3—5d开始第一次分裂，并能持续分裂至形成胚性细胞团。较为适宜的培养条件是附加O．5mg．一N从及1．Omg．Lfl6一BA的MS。培养基；稍低的温度(21±O．5℃)；1501x的持续光照；培养密度为5×105个．m一：采用液体浅层和双层培养在出现分裂时间、分裂频率等方面均优于琼脂糖包埋法和琼脂岛培养法，但液体浅层培养中细胞持续分裂较弱；暗处理24h的叶片原生质体在培养中其内含物的外溢及质膜破裂情况均明显减少，且分裂能力提高2．2％；培养基中添加5

3、0mg．L1的抗坏血酸、5mg．L1的cacl：、100mg．L1的精氨酸均使原生质体的分裂能力有所提高：但低温处理(5℃)24h的叶片，其原生质体的产量与存活率没有提高，反而有所下降，分裂能力也无明显变化。本研究论文之二是以铁皮石斛的离体根尖为外植体，研究了在不同的培养条件下离体根尖经愈伤组织形成体细胞胚、直接产生体细胞胚及直接形成芽后再生植株。在改良Bs(微量元素为原来的l／3)中加入1．Omg．r2，4一D和3．Omg．L_16一BA对离体根尖的愈伤组织诱导较为合适，0．5mg．L_lN从有利于从愈伤组织上产生体细胞胚；6一BA明显促进离体根尖直接产生类原球茎，而

4、N从则有阻碍作用；同时N从的存在也使离体根尖直接成芽的时间延长。对其再生植株的过程进行细胞学观察后认为铁皮石斛的类原球茎是单细胞起源的真正的体细胞胚。关键词：石斛；原生质体培养；细胞分裂；愈伤组织；类原球茎；体细胞胚发生ABS’lIltAC’l’E丘色ctsofisolated如dcultIm羽onprotoplastsderived丘omyoungleaVesofDe砌6f“mQ历cfn讲BXl聊“mef肘辔D踮pectictIlbeplantletwerediscussedin也ep印eLInollrstudy'theappm砸ateconditioninisoIa

5、tepr叩toplastisb硒icsolutioncontainedO．5％Pec血舔e∞d1．O％Celhd弱eOno孤kaR-lO．The妇eofenzyme订钱【nnentis6h．Osmoticmedi啪conce芏l一订ationisO．5M．Thesugarissup鲥ortom籼it01aIldglucose．Howevetin也eosmoticmedi啪tlleyieldisdecreaSedwithjn28．7—38．1％．If山eb雒icsDluti(mcoⅡtained1SOmg．L．1蹈cofbicacid鼬d20mg．L”cacl2、vill

6、mcre懿edmeactiv时ofprot叩last9．2％and15．7％．MorcoVer’if协eyoungleafpieceswereplaSm01yzedbeforeincubated洒en巧mesolutiDnwillincreasedtlleyieldandactiVityofpmtoplast3．23％and4．2％．InⅡlecultllreofmeprotoplast，伽e缶stdiVisionoccurred诵thin3to5days，andtheembryogenjcceIlclustcrcomdbeobserved30days心ercultur

7、e．neapprop血teconditioninthecult眦eisMSlsupplemem—ed埘th0．5mg．L_1NAAa王订1．Omg．L．16～BA．Forpro：oplastsurviVali11theiIlitiaIculturerelativelyJowtemperanJre(2l士0．5℃)aildlowlightimensiq(1501x)areprcferable．CulturedeIlsi谚is5×10’cell．mL．‘，The1lqIlidtlliIlculnlreanda嚣ose-1iquiddou_bl