沉默COL1A1的小干扰RNA表达质粒建立及抑制COL1A1表达的有效序列的筛选

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1、·英文缩略语·5中国医科大学研究生学位论文独创性声明本人申明所呈交的学位论文是我本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得我校或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料，与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任。．论文作者签名：乒卜中国医科大学研究生学位论文版权使用授权书本人完全了解中国医科大学有关

2、保护知识产权的规定，即：研究生在攻读学位期间论文工作的知识产权单位属中国医科大学。本人保证毕业离校后，发表论文或使用论文工作成果时署名单位为中国医科大学，且导师为通讯作者，通讯作者单位亦署名为中国医科大学。学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。学校可以公布学位论文的全部或部分内容(保密内容除外)，以采用影印、缩印或其他手段保存论文。论文作者签名：型夏指导教师签名：益笙趁日期：盛堕：壬·中文论著摘要·沉默COLlAl的小干扰RNA表达质粒建立及抑制COLl

3、Al表达的有效序列的筛选目的肝纤维化是慢性肝病共有的病理改变，其本质是以胶原为主的ECM合成增多，而降解相对减少，两者失去动态平衡，致使过多ECM沉积于肝内，ECM中主要成分是胶原，而胶原中以I型胶原蛋白为主，现已证明HSC激活是产生I型胶原导致纤维化发生发展的中心环节。RNA干扰(RNAi)是一种能达到特异性抑制目的基因表达的现象，己成功地下调了一些内源性基因的表达。我们目的是通过构建表达COLlAl小干扰RNA(siRNAs)的质粒，筛选出对肝星状细胞中I胶原有影响序列。方法从NCBI网站获

4、得大鼠的COLlAlcDNA序列，根据Whitehead研究所的siRNA设计软件设计3条理论上最佳的siRNA序列，相应的双链DNA被插入pGPU6／GFP／Neo质粒中，即pGPU6／GFP／Neo-shRNA-A、pGPU6／GFP／Neo—shRNA-B、pGPU6／GFP／Neo-shRNA—C。为了得到高效沉默COLlAl--siRNA，以脂质体LipofectAMINE2000将各组siRNAlug、2lag、3Ilg、4ug转染含荧光蛋白(GFP)质粒于HSC—T6细胞中，观察转

5、染效果。然后，将最佳沉默siRNA剂量导入HSC．T6细胞，转染后24h传代，加入G418进行筛选，2周后挑取单克隆株扩大培养。获得稳定表达细胞系，分别建立表达pGPU6／GFP／Neo—shRNA-A、pGPU6／GFP／Neo—shRNA—B、pGPU6／GFP／Neo—shRNA—C和阴性对照的单克隆大鼠肝星状细胞株。应用RT-PCR分析pGPU6／GFP／Neo—shRNA—A、pGPU6／GFP／Neo—shRNA-B、pGPU6／GFP／Neo—shRNA—C、pGPU6／GFP／N

6、eo-shRNA-N组的COL1AlmRNA的表达水平。硅里=口木靶向COLlAlmRNA的3个shRNA重组质粒载体pGPU6／GFP／Neo．shRNA．A、pGPU6／GFP／Neo·shRNA-B、pGPU6／GFP／Neo．shRNA-C经测序分析，shRNA编码序列与设计的片段完全一致，经酶切凝胶电泳证实载体构建成功。观察1u昏2u卧3ug、4ug组转染效果分别为16．7％、20．3％、23．5％、22．3％，以2ugsiRNA为最佳剂量，RT-PCR分析pGPU6／GFP／Neo—

7、shRNA．A、pGPU6／GFP／Neo．shRNA．B、pGPU6／GFP／Neo—shRNA-C，对COLlAlmRNA的抑制率分别为16．6％、63．3％、80．3％。结论耋口y匕筛选出的pGPU6／GFP／Neo-shRNA．C表达质粒能高效地抑制转染细胞COLlAlmRNA的表达，从而为肝纤维治疗提供新的方法和材料。关键词前I型胶原Q1链：肝星状细胞；RNA干扰；质粒2·英文论著摘要·ConstructionCOLlAl-·shRNAExpressionPLasmidAndSelec

8、tEffectiveSequenceAIMLiverfibrosisisapathologicalchangesofthechronicliverdisease，itsessenceiscollagensynthesisincreased，anddegradationreduced，thedisturbanceofthetwodynamicbalance，resultinginliverECMdeposition．themainingredientofECMiscollagen,Collagen