弓形虫SAG1基因原核表达与间接ELISA检测方法的建立

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1、朱冠虹：弓形虫SAGI基因原核表达与间接ELISA检测方法的建立弓形虫SAGl基因表达与间接ELISA检测方法的建立研究生：朱冠虹导师：高诚研究员摘要弓形虫(Toxoplasmagondii)是一种专性细胞内寄生的机会致病原虫(opportunisticprotozoan)，能感染几乎所有恒温动物(包括人类)，引起弓形虫病。在免疫功能正常的宿主体内通常形成包囊，造成隐性感染；对于免疫功能下降的宿主(如肿瘤患者、器官移植者及AIDS患者等)，可引起严重的临床症状甚至导致宿主死亡。弓形虫膜表面蛋白l(SAGl)是弓形虫速殖子期的特异性抗原，具有很强的免疫

2、原性，是弓形虫诊断和疫苗研究的重要候选抗原分子。SAGl在原虫中含量较低，利用基因工程技术在体外表达蛋白可以获得大量高纯度SAGl。本研究根据己发表的SAGl基因序列设计特异性引物，以弓形虫基因组DNA为模板，利用PCR方法扩增出SAGl基因的主要抗原片段P30(S)，构建T-A克隆，经PCR扩增和酶切鉴定后进行测序。将正确的P30(S)基因片段亚克隆入pET-28a(+)原核表达载体中，重组质粒转化大肠杆菌说2J，经IPTG诱导表达得到重组蛋白P30(S)。纯化后的P30(S)经SDS．PAGE与Western．blot验证，该融合蛋白分子量大小介

3、于26．35kD之间，符合预期大小；可与大鼠弓形虫病阳性血清发生特异性反应，具有良好的免疫原性，可以作为抗原检测大鼠弓形虫病血清抗体。以纯化的P30(S)作为包被抗原，经试验确定最佳抗原包被浓度、血清和酶标抗体稀释浓度，建立大鼠弓形虫病抗体间接ELISA检测方法。通过特异性试验、敏感性试验、稳定性试验以及对比试验，表明本研究建立的间接ELISA方法特异性强、敏感度高、重复性好，为试剂盒的研制与开发奠定了基础关键词：大鼠弓形虫病；SAGl；克隆；原核表达；酶联免疫吸附实验扬州大学硕士学位论文ExpressionofSAG1inE．coliandDeve

4、lopmentofan2一IndirectELISAforDetectionofAnti—T．gondiiAntibodiesM．S．candidate：ZhuGuanhongSupervisor：Prof．GaoChengAbstractToxoplasmagondii(T．gondii)，ailobligateintracellularprotozoanparasite，isabletoinfectallspeciesofmammals(includinghuman)andbirds．Itisallopportunisticprotozoanan

5、dresponsiblefortoxoplasmosis．Thehostsusuallyhavenosymptomwithanormalimmunesystem．Inthehostswhoareimmunocompromised(e．g，neoplasticdisease，organtransplantation，andAIDSpatients)，thetachyzoitesofT．gondiimayfrequentlycauseaserioussymptomsandsubsequentcomplications，evendeathsometimes

6、．SAGlprotein,amajorsurfaceantigenofT．gondii，isahighlyimmunogenicproteinindiagnosisandvaccine．OnlyalittlecallitbederivedfromT．gondiihowever．WhenweneedlargeamountsofpuredSAG1，geneticengineeringtechniqueischosenalottoexperessthetargetproteininvitro．AccordingtotheSAG1genesequenceof

7、T．gondiipublishedonGenBank,apairofprimersWasdesignedtoamplifyapartofgeneofSAGlbyPCRtechnique．ThePCRproductWaspurifiedandclonedintopMD18·Tvector．WhenthetargetDNAsequenceWastestified，itWassubclonedintoprokaryoticexpressingvectorpET·28“+)andtransfectedintoE．colisWainBL21．Inducedby

8、IPTG,thetransformantexpresstherecombinantprotein．There