大肠杆菌表达的新一代重组人内皮抑素复性条件的优化

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1、中国医学科学院＆北京协和医学院硕士研究生毕业论文摘要’目的：优化重组人血管内皮细胞生长抑制素(d厄D)的复性方案，以提高其复性率，并初步检测复性后n也D抗血管生成的生物活性，为订1ED的进一步研究与利用提供大量的有活性的订_lED蛋白。方法：用带有r11EDcDNA的pQE3表达载体转染大肠杆菌EcDZfMl5，在皿TG的诱导下发酵产生订lED包涵体并提取rhED包涵体。复性时，先用6mol／L盐酸胍溶解提取后栅包涵体，在适宜的尿素浓度下稀释蛋白液并搅拌足够长的时间，结合逐级透析法进行复性，找出复性的主要影响因子，并优化最适复性条件。然后，利用标准曲线法

2、测量—：lED的浓度，SDS姒GE验证并计算复性得率。复性结束后阳离子交换层析纯化n1ED并超滤浓缩至适宜浓度。最后，用衄D特异性单克隆抗体和鸡胚绒毛尿囊膜抑制血管生长实验检测复性后蛋白的活性。结果：lL的rhED菌种发酵液能产生159衄D包涵体。通过优化复性条件，她D的复性率可达到46％。其中有三大重要的复性影响因素——复性时蛋白液的浓度、尿素浓度及pH值。复性时蛋白的浓度为O．3m∥IIll、尿素浓度为3．5mol／L及pH为8时是适宜的复性条件。而阳离子交换层析能很好的纯化复性后的rhED。通过复性、纯化后的rl也D能与眦D特异性单抗反应，并在鸡胚

3、绒毛尿囊膜抑制血管生长实验中显示出抑制血管生长的活性。结论：至此提高妣D复性率的复性条件已经确立，本复性方案将极大地促进妣D的临床前研究及临床研究。关键词：重组人内皮抑素，复性，纯化，鸡胚绒毛尿囊膜实验中国医学科学院＆北京协和医学院硕士研究生毕业论文optimizationofrefoldingandpurificationofanoVelrecombinanthumanendostatinf}omjecD聒AbstractObjectiv骼：To0ptimizetheconditionsfbreIlll肌ciI玛therefoldingofrh—end

4、ostatin(rIlED)fj吣mE∞以a11dtestmebiolo酉calactivitiesofrefoldednlEDa11dforthemtherresearchaIlduseofnlED．Methods：nerhEDinclusionbodywasobtainedbyfermentingE∞以(strainM15)con诅ininghumaIlendostatincDNAwhiChwasligatedtoplasIIlidpQE3whenitwasinducedby胛G111epanialp嘶fiedinclusionbOdiesOfdlE

5、DweredissolVedwim6mo儿Gu枷dine-HCLfollowingbycombinationofdilutioninadiluentcon_tai血gappfo皿ateconcen昀tionofureafbranenou曲timea11ddialysisins嘶esbuf融．softhedissolVedendostatin．TherhEDconcen仃ationaRerrefoldedwasdeteminedbyastandardcurveassayandSDS干AGE，alldcalculatedtherefoldingyield．T

6、herefolded妣Dwasthenpmifiedbycation吒xchangemethodandconcentratedbyul仃afiltration．Thebiolo酉calactivitiesofpurifieddlEDwereassessedbyusingrhED_specificmonoclonal锄tibOdy锄dcllickembryochorioallantoicmembraneassay．Results：Fi肌en伊amsperliterofrhEDinclusionbodywasachieVedbyfe咖emationofE∞矗

7、witll鼻ec锄binantendostatinfj温gmentin20Lbio哦IactIDr．Andthe46％(w／w)refoldingyieldwasachieVeda舭roptiIIlizingtheconditionsofrefoldingInethodaf=tera肌nlbersofcomp耐sonstudies．TIllreeconditionswere嘶ticalt0obtainhigll妒eldofrefoldedrhED：thestaftingrefoldingproteinconce嘶ation，ureaConcentrati

8、on，aIldpHindialysisbuff酹sduriIlgmerefold