C636细胞感染登革Ⅱ型病毒相关表达蛋白的初步鉴定

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1、rfl山人学硕}j学f妒论文C6／36细胞感染登苹II掣病毒相关表达蛋门的初步鉴定C6／36细胞感染登革II型病毒相关表达蛋白的初步鉴定专业：病原生物学研究生：李廷庆导师：郑小英副教授中山大学中山医学院寄生虫学教研室(510089)摘要登革病毒(Denguevirus，DEN)属黄病毒科黄病毒属，包括4个血清型，可引起人类登革热(denguefever，DF)、登革出血热(denguehemorrhagicfever，DHF)和登革休克综合征(dengueshocksyndrome，DSS)。据世界卫生组织估计，目前全球约25亿人口受到登革病毒感染的威胁【11。广东是登革热的重

2、流行区，多次暴发流行。白纹伊蚊是登革病毒的重要媒介，自然叮咬吸血带登革病毒雌蚊可以带毒持续26天【2】。登革病毒在媒介伊蚊体内繁殖至一定数目时，病毒含量不再增加，病毒能在媒介伊蚊体内存在，但媒介伊蚊有控制病毒繁殖的现象，蚊虫与病毒表现为“共处”，显示蚊虫体内存在控制病毒繁殖的机制。生物体功能的主要执行者是蛋白质，在蛋白质水平研究生物性能可更准确阐明细胞内变化机制，但对蚊感染登革病毒后蛋白质水平上的变化研究较少，了解宿主相应细胞在感染登革病毒后蛋白表达变化以及发生机制对研究设计登革病毒药物靶标具有实际意义，值得我们进一步研究。1994年，MarcWilkins在Siena双向凝胶

3、电泳(two．dimensionalelectrophoresis，2一DE)会议上最早提出了蛋白质组(proteome)概念，并于1995年7月的Electmphoresis杂志上发表■蛋白质组学技术已成为后基因组时代发现疾病相关I

4、i山人学颂l：学位论文c6／36细胞感染登筝II掣病毒相关表达蛋rl的初步鉴定蛋白、寻找日．期诊断标记和揭示致病机制的有力工具【4l。其中，差异蛋白质组学是蛋白质组学研究的一种重要研究策略，着重于筛选和鉴定不同种类或状态卜．各样本之间蛋白质组的区别与变化，具有很强的可行性151。白纹伊蚊C6／36细胞感染髓革II型病毒后蛋白质表达可能发生变化，研

5、究此差异表达蛋白质将为揭示病毒与宿．}细胞的相互作用机制与病毒的分子致病机制，寻找病毒的作用靶标等研究提供有意义的信息【6J。研究的目的和意义本研究拟运用SDS．PAGE技术，分离白纹伊蚊C6／36细胞感染登革II型病毒前后显著的差异蛋白，进行western．blot和质谱鉴定，找出病毒感染后所诱导的新的蛋白成分，并鉴定蛋白种类为今后分析这些蛋白对细胞控制病毒感染的作用机制、病毒与宿辛细胞的相瓦作用机制、病毒的分子致病机制、寻找病毒的作用靶标等，及为登革热的监测防治提供基础和新思路。研究内容和方法分离并培养白纹伊蚊C6／36细胞，提取C6／36细胞和登革病毒感染后的C6／36细

6、胞的总蛋白质进行SDS．PAGE凝胶电泳，对比分析C6／36细胞感染登革病毒前后电泳图谱的差异。提取正常C6／36细胞总蛋白质免疫小鼠，提取血清做一抗，羊抗小鼠lgG做二抗识别，westernblot鉴定C6／36细胞感染登革病毒前后SDS—PAGE凝胶电泳谱中的差异条带是否为C6／36细胞表达的蛋白。用登革热病人血清做一抗，兔抗人lgG做二抗识别，westernblot鉴定C6／36细胞感染登革病毒前后SDS．PAGE凝胶电泳谱中的差异条带是否为登革病毒表达蛋白。取C6／36细胞感染登革病毒后的SDS．PAGE凝胶图谱中约40KDa处和约70KDa的蛋白条带免疫Balb／e小

7、鼠，提取血清做一抗，羊抗小鼠IgG做二抗识别，westernblot鉴别C6／36细胞感染登革病毒前后的差异蛋白是否均具有抗原性。切取SDS．PAGE凝胶电泳谱中呈现明显表达差异的约40KDa处和约70KDallIlJl人学颁I：学何论文c6／36细胞感染登筝II犁病毒卡u关表达蛋广1的初步鉴定蛋白条带，酶解后进行串联时问飞行质谱，分析其蛋白组成成份。研究结果1．提取正常C6／36细胞和登革病毒感染后C6／36细胞的总蛋白质，进行SDS．PAGE凝胶电泳，获得C6／36细胞感染登革病毒前后的SDS．PAGE电泳图谱，约40KDa和约70KDa处的蛋白条带在C6／36细胞感染登革

8、病毒后呈现明显表达上调。2．分别以Balb／c小鼠抗C6／36细胞免疫血清、登革病人血清、Balb／c小鼠抗约40KDa处差异条带免疫血清和抗约70KDa处差异条带(登革病毒感染后的C6／36细胞)免疫血清作为一抗，分别进行westernblot检测，结果显示C6／36细胞感染登革病毒前后的约40KDa处蛋白质和约70KDa处蛋白质均不足登革病毒在细胞表达的蛋白质，而是C6／36细胞本身表达的蛋白质。C6／36细胞感染前后的40kDa和70kDa蛋白条带同源。3．取40KDa处和70KDa处