转染登革ⅱ型病毒前膜蛋白基因反向重复序列的bhk-21细胞沉默病毒复制研究

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1、南方医科大学2010级硕士学位论文转染登革II型病毒前膜蛋白基因反向重复序列的BHK一21细胞沉默病毒复制研究Aninverted-repeatRNAconstructforsilencingdenguevirus哆pe2pre·membranegenesuppressesviralreplicationinBHK．21cells课题来源：国家自然基金项目(NO：30872198；30972566)学位申请人导师姓名专业名称培养类型培养层次所在学院朱娉婷郑学礼病原生物学学术型硕士公共卫生与热带医学学院2013年月日广州硕士学位论文转染登革II型病毒前膜蛋白基因反

2、向重复序列的BHK．21细胞沉默病毒复制研究硕士研究生：朱娉婷指导教师：郑学礼教授摘要登革病毒(denguerivus，DENV)属于黄病毒科(Flavivirade)黄病毒属(Flavivirus)，由其感染所引起的疾病包括：登革热(denguefever，DF)，登革出血热(denguehemorrhagicfever，DHF)和登革休克综合症(dengueshocksyndrome，DSS)。严重的登革出血热(登革出血热和登革休克综合症)，20世纪50年代在菲律宾和泰国登革热流行期间被首次确认【l】。截止至2012年11月WHO报告，近几十年来，世界各地的

3、登革热发病率大幅增长。世界上二分之一的人口，非洲，美洲，东地中海，东南亚和西太平洋地区超过100个国家处于登革热流行的威胁中，2008年，美洲、东南亚和西太平洋地区的国家登革热病毒感染报告病例数120万，而到2010年，报告病例数上升至230万，最近报告病例仍在持续增加121。登革热不仅发病率和病死率呈上升趋势，而且暴发疫情的地区也呈扩大化的趋势，以前从未发现过登革热疫情的国家遭受登革病毒的威胁【3，4】。登革热在2012年被WHO列为传播速度最快的媒介传播病毒性疾病，它具有在世界上出现流行的可能性。全世界需要改变应对方式，并实施可持续性预防措施【2】。登革热成

4、为全球关注的热点。目前控制登革热的方法主要是用化学方法控制传播媒介，这种方法对登革病毒的预防和控制发挥了举足轻重的作用。然而，随着杀虫剂等化学制剂的广泛应用，这种方法亦产生许多的负面影响：蚊虫产生抗药基因，破坏环境一化学制剂残留于环境中。同时，由于热带和亚热带地区城市化进程加快以及国际问摘要交流的增加导致白纹伊蚊活动范围扩大‘5_】，登革病毒的疫区产生扩大化趋势。因而，有学者指出，应对登革病毒传播需要有效的新策略。如加紧致力于新型有效疫苗的研发，通过基因修饰或操纵传播媒介等。通过基因修饰传播媒介，改变病毒感染的宿主易感性，从而达到媒介中病毒复制的降低或消除，这种

5、方法称为源于病原体的抵抗(pathogen．derivedresistance，DPR)18-9J。DPR最早在植物中发现，合成的烟草花叶病毒外壳蛋白在转基因植物中的表达有效地保护了植物来自同源病毒的攻击。这种现象后来被命名为RNA干扰效应。RNA干扰是指一种分子生物学上由双链RNA诱发的基因沉默现象，RNAi被发现广泛存在于生物界，从低等原核生物、真菌、无脊椎动物、哺乳动物中也发现了此种现象。RNAi抗病毒的效应已在多种媒介昆虫中发现，RonaldP．van鼬i【lo】等发现，黑腹果蝇中R．NAi途径中关键酶Ago一2缺陷株体内病毒RNA呈高水平累积；Varg

6、as[11J等通过敲除RNAi途径中的AGO．2、Dcr-2和R2D2的表达后，能增加登革II型病毒在埃及伊蚊体内的复制。有研究者已开始利用RNAi干扰的技术修饰或改造媒介，使得媒介减少携带或者不携带病毒。AnthonyKG等112-14】通过引入dsRNA已成功用于抑制西尼罗河病毒(WNV)、日本脑炎病毒(JEV)和黄热病毒(YFV)的复制；FranzAW等‘15。16】经短片段RNA(shortinterferingRNA，siRNA)改造的转基因蚊有效地阻止病毒的感染和传播；Zhang等【1‘7】通过腺病毒载体转染短发夹RNA(shorthairpinRN

7、A，shRNA)至哺乳动物细胞内，对DENV-2复制产生干扰效应，抑制病毒的复制。RNAi有望成防控登革病毒感染的新策略。登革病毒的基因组为单股正链RNA分子，约含11000个碱基，具有单一的可读框，编码三种结构蛋白和七种非结构蛋白，其编码基因顺序为：5’．C．prM．E．NSl-NS2A-NS2B-NS3-NS4A．NS4B-NS5．3’。其中prM蛋白的切割被认为是未成熟病毒颗粒向成熟病毒颗粒转变的关键步骤，与病毒的装配、成熟和维持病毒的感染性有关118-19】。因而，prM被许多研究者选为触发RNAi的效应基因。成功介导RNAi还需稳定高效的表达系统。质粒

8、作为载体导入效应基因有以