登革ⅱ型病毒非结构蛋白ns3的鉴定及功能的初步分析

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1、登革II型病毒非结构蛋白NS3的鉴定及功能的初步分析IdentificationandpreliminariIyf．unctionalanaIysisofdengueVimstypeIINS3protem课题来源：国家自然基金项目(NO：30872198；30972566)学位申请导师姓专业名培养类培养层所在学人朱碧青名郑学礼教授称病原生物学型学术型次硕士研究生院公共卫生与热带医学学院答辩委员会主席答辩委员会委员论文评阅人余新炳教授吴忠道教授朱家勇教授伦兆荣教授黄曦教授闰桂云教授吕芳丽教授周晓红教授2014年3月28日广州硕士学位论文J舢JJ脚舢删

2、删J舢舢删㈣艘Y2617950登革II型病毒非结构蛋白NS3的鉴定及功能的初步分析硕士研究生：朱碧青指导老师：郑学礼教授摘要登革热((1enguefeVer，DF)、登革出血热(denguehaemomlagicfever，DHF)和登革休克综合症(dengueshocksylldrome，DSS)是由登革病毒(DenglIev加s，DENV)引起的虫媒传染病。DDⅣ分为4个血清型：D盼Ⅳ．I、DENV．II、DENV．III和DENV．IV。该病主要通过埃及伊蚊和白纹伊蚊传播，流行于全球热带及亚热带地区。WHO估计全球每年有约发生5000万到1亿

3、例登革热，其中超过25ooO人死于该疾病，特别是在亚洲、太平洋群岛及中、南美洲许多国家都已构成严重的威胁。目前，仍然没有有效的抗登革病毒药物和登革病毒疫苗用于临床。因此登革热已经成为了严重的公共卫生问题之一。登革病毒是有包膜的单股正链RNA病毒，由11000个核苷酸组成。其基因组编码成一个多肽链后，在宿主的信号肽酶及病毒编码的蛋白酶(NS3)作用下，裂解成3种结构蛋白(衣壳蛋白C、膜蛋白及其前体M／_prM、包膜蛋白E)和7种非结构蛋白(NSl、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B、NS5)。在黄病毒属蛋白酶作用其自身编码的多聚蛋白底物的

4、过程中，非结构蛋白3(NS3)扮演相当重要的角色。登革病毒非结构蛋白NS3是DENV的第二大非结构蛋白，基因全长1854bp，编码618个氨基酸。Ns3是一种分子量为大约69KDa的亲水性的多功能蛋白，具有蛋白酶、RNA解旋酶和I斟A聚合酶多重活性，在病毒的复制和成熟过程中起着重要的作用。摘要通过生物信息学分析，NS3蛋白是亚细胞内定位在内质网上的一个膜外蛋白。Ns3蛋白含两个结构域，N末端的180个氨基酸为丝氨酸蛋白酶区域，其中最少需要N端167个氨基酸才能发挥丝氨酸蛋白酶的活性；C末端的438个氨基酸含有另外三种酶结构，即RNA解旋酶和NTPa

5、se和5’RNA三磷酸酶的活性，参与病毒前体的加工和病毒RNA的复制及基因组RNA的5’端加帽，即调节核酸的拓扑结构。虽然解旋酶在病毒的生命周期中尚不清楚其具体的作用，但是一般认为在病毒利用自身酶聚合时，解旋酶是暂时分离中间体dsI矾A。这种分离机制将更易于病毒的几轮的复制。另外，解旋酶还可能打乱二级结构形成ss砌悄模板或取代宿主其他病毒蛋白结合到dsRNA，更易于病毒RNA的复制。NS3的RNA5’三磷酸酶活性可能与病毒基因组的5’加帽反应有关，因为加帽的第一步反应是I矾A5’端的磷酸集团的水解，Bartelma等人首先证实了登革病毒NS3的RN

6、A5’三磷酸酶的活性。并有文献报道NS3蛋白具有良好的免疫原性，存在特异性的CD4+和CD8+识别表位，可诱导机体产生B、T细胞应答且可在NS2B激活蛋白酶的辅助下，促使NS3与膜的融合，诱导细胞凋亡。目前，通过设计特异性酶抑制剂作为治疗病毒疾病的药物，是一种抗病毒的新策略，在与登革病毒同属一个家族的HCV就已经取得了很大的进展，已经有HCV的NS3抑制剂类药物处于临床试验阶段。鉴于NS3同时具有病毒复制所必需的多种酶活性及其良好的免疫原性，且已有研究表明，NS3蛋白在不同血清型的登革病毒及黄病毒中相对保守，能在病人和受试者体内可诱导产生较好的免疫

7、保护反应，故使得登革病毒NS3成为具有潜力的靶分子。为进一步研究NS3蛋白在登革病毒感染中的作用及作为检测靶抗原的可能性，本课题构建NS3蛋白的原核及真核表达载体，通过克隆，表达及纯化，探讨NS3蛋白对登革II型病毒复制的影响，为深入阐明登革病毒的致病机理提供有意义的实验依据，为迸一步设计抗病毒感染的疫苗开发提供新的思路。本研究主要结果与结论如下：一、登革病毒NS3蛋白的生物信息学分析1．利用生物信息学软件，对黄病毒属不同病毒(DENv、厄V、TBEV、WNV、TT硕士学位论文YFV)的NS3蛋白及其结构域进行分析，Ns3蛋白在不同的血清型及黄病毒

8、属中存在保守序列；通过构建进化树发现，登革II型NS3蛋白与登革Ⅳ型亲缘关系比较近，与黄病毒属中的日本脑炎病毒及西尼河病毒