理学]分子荧光光度法

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1、第一节概述Generalization第二节基本原理Principles第三节定量分析方法Fluorometer第四节仪器与技术QuantatitiveAnalysis第五节应用Apply第五章分子荧光分析法MolecularFluorescenceAnalysis第一节概述Generalization一、光致发光物质分子吸收一定能量的光后发射出的光辐射。荧光（Fluorescence)持续时间：10-9~10-6s磷光（Phosphorescence)持续时间：10-3~10s利用测量荧光强度而建立的物质含量分析方法。二、荧光光度法第二节基本原理Princ

2、iples一、分子荧光的发生过程（一）分子的能级与电子能级的多重性1.分子的能级跃迁①每个分子具有严格分立的能级。②基态分子吸收了特征频率能量后，从低能级向高能级跃迁，即处于不同的激发态。hvEiEjΔE=Ej–Ei=hv2.分子的激发态1）基态时，电子在各原子或分子轨道中成对存在。在某一给定轨道中的两个电子具有相反的自旋（自旋配对）。2）所有电子自旋都配对的分子电子态叫基态单重态（S0)基态单重态（S0）3)处于基态单重态的电子对，其中一个电子被激发到某一较高能级时，受激电子的自旋仍然与处于基态的电子配对，称为激发单重态（S）激发单重态（S）4

3、)处于基态单重态的电子对，其中一个电子被激发到某一较高能级时，两个电子的自旋相互平行，称为激发三重态（T）激发三重态（T）激发单重态的平均寿命大约10-8s，而激发三重态的平均寿命大10-4～1s以上；由基态单重态向激发三重态跃迁（S0→T*)属于禁阻跃迁，而由基态单重态跃迁到激发单重态（S0→S*)是允许跃迁。（二）荧光和磷光的产生-----最常见去活化过程：激发态分子在极短的时间内回到基态的过程。无辐射跃迁体系跨越辐射跃迁途径1.无辐射跃迁振动驰豫内转换体系跨越外转换①振动驰豫较高能级分子与其它分子（样品或溶剂）碰撞，能量变为热能。②内转换和体系跨越当

4、两个相邻电子能级相距较近以致其振动能级重叠，电子由较高电子能级以无辐射跃迁方式至低一级电子能级，称为内转换。电子由激发单重态向激发三重态（S1*→T1*)的无辐射跃迁称为体系跨越。S2*→S1*T2*→T1*内转换体系跨越S1*→T1*③外转换受激分子与溶剂或其它溶质分子间的相互作用和能量转移。外转换使分子的荧光或磷光减弱甚至消失，这一现象称为“熄灭”或“淬灭”。2.辐射跃迁----荧光和磷光处于电子激发态的分子（S1*或T1*）通过光发射回到电子基态，称为辐射跃迁。S1*→S0T1*→S0----荧光----磷光①②λ荧<λ磷③强度F磷

5、0-6~10-9s，τ磷=10-4~xs内转换体系跨越外转换S1S2S0T1吸收λ1吸收λ2荧光λ3磷光λ4无辐射跃迁振动驰豫固定测量波长(选最大发射波长),化合物发射的荧光(磷光)强度与照射光波长的关系曲线（图中曲线I）。激发光谱曲线的最高处，处于激发态的分子最多，荧光强度最大。二、激发光谱与荧光光谱1.荧光(磷光)的激发光谱曲线测定荧光(磷光)强度的仪器装置示意图固定激发光波长(选最大激发波长),化合物发射的荧光(或磷光强度)与发射光波长关系曲线(图中曲线II或III)。2.荧光光谱(或磷光光谱)3.激发光谱与发射光谱的关系（1）Stokes位移激发光谱与

6、发射光谱之间的波长差值。发射光谱的波长比激发光谱的长，振动弛豫消耗了能量。（2）发射光谱的形状与激发波长无关电子跃迁到不同激发态能级，吸收不同波长的能量（如能级图2,1），产生不同吸收带，但均回到第一激发单重态的最低振动能级再跃迁回到基态，产生波长一定的荧光（如’2）。通常荧光发射光谱与它的吸收光谱（与激发光谱形状一样）成镜像对称关系。（3）镜像规则镜像规则的解释：基态上的各振动能级分布与第一激发态上的各振动能级分布类似。基态上的零振动能级与第一激发态的二振动能级之间的跃迁几率最大，相反跃迁也然。200250300350400450500荧光激发光谱荧光

7、发射光谱nm蒽的激发光谱和荧光光谱三、物质分子结构与荧光的关系（一）荧光效率（φf）激发态分子中以发射荧光的光量子数目和分子吸收激发光的光量子总数之比：发射荧光的光量子数目吸收激发光的光量子总数φf=[φf∈（0，1）]分子产生荧光必须具备的条件:（1）具有合适的结构（共轭刚性平面结构）（2）具有一定的荧光量子产率激发态的分子有几种途径可以回到基态,荧光去激发比其它去激发快,才可以观察到荧光发射。荧光效率越大,分子产生荧光的能力越大。（二）分子结构与荧光→*的荧光效率高，系间跨越过程的速率常数小，有利于荧光的产生。1.跃迁类型提高共轭程度有利于增加荧光

8、效率并产生红移。2.长共轭效应-共