荧光光度法课件.ppt

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1、第九章分子荧光光度法MolecularFluorescenceSpectrophotometry分子荧光光度法概述去活过程及荧光和磷光的产生物质分子结构与荧光的关系环境对荧光的影响荧光定量分析方法荧光分光光度计内容概述：一种物质能否发射荧光，取决于它的分子结构和它所处的环境条件。概述：分子结构：分子中含有共轭双键体系，具有吸收辐射能，产生电子跃迁的能力。环境条件：适当的辐射能照射，温度、溶剂、酸碱度等。概述：荧光光谱的范围较广，可以从X光到红外光谱区。某些物质受紫外光照射后能发射比吸收的紫外光波长更长的紫外光荧光或可见

2、荧光。基本概念：光致发光：当物质吸收电磁辐射并被激发后产生的一种发光形式。分子荧光光度法：利用物质分子发出荧光的强度（F）进行分析的方法。用途定性分析：由于不同物质结构不同，吸收的激发光波长也不同，利用这一性质可以鉴别物质。定量测定：同一物质的稀溶液，浓度大的荧光较强，反之则较弱，利用这一性质可进行定量测定。荧光光度法的特点：优点：灵敏度高，可达ng/ml；选择性强，重现性好；取样少；可提供较多物理参数。缺点：许多物质本身不能发射荧光，因此，应用不够广泛。荧光法与UV-Vis法的比较：相同点：都需要吸收紫外-可见光，产生

3、电子能级跃迁。荧光法与UV-Vis法的比较：不同点：UV-Vis法测定的是物质溶液对紫外-可见光的吸收程度(A)。荧光法测定的是物质经紫外-可见光照射后发射出的荧光的强度(F)。荧光和磷光光谱法激发态第一激发态最低振动能级基态S=±1/2（自旋量子数）M=2S+1（电子能态多重性）分子的激发态单重态：当基态分子的电子都配对时，S=0，多重性M=1，这样的电子能态称为单重态。单重电子激发态：当基态分子的成对电子吸收光能之后，被激发到某一激发态上。如果它的自旋方向不变，S=0，M=1，这时的激发态叫单重电子激发态。分子的激发

4、态图示：单重电子激发态基态分子的激发态三重电子激发态：若通过分子内部的一些能量转移，或能阶间的跨越，成对电子中的一个电子自旋方向倒转，使两个电子自旋方向相同而不配对，这时S=1，M=3，这种电子激发态称三重电子激发态（三重态）。分子的激发态激发态三重电子激发态S=1，M=3去活过程及荧光的产生物质分子处于基态最低振动能级紫外光照射，吸收两个能级之差的能量跃迁至单重电子激发态的多个能级由于分子之间的振动与撞击，能量降至第一激发态最低振动能级。去活过程及荧光的产生激发态较高能级激发态较高能级激发态最低能级基态各能级产生荧光能

5、量以热的形式释放（无辐射迁）能量以光量子形式释放去活过程处于激发态各不同振动能级的电子无辐射跃迁去活过程产生荧光基态磷光的产生激发态分子单重电子激发态最低振动能级无辐射跃迁第一电子三重激发态无辐射跃迁（体系跨越）降至基态各能级光辐射，产生磷光磷光和荧光的区别荧光磷光产生S1*最低振动能级基态三重态基态波长较短较长寿命10-8S′10-4～几秒几率较大少见激发光谱和荧光光谱激发光谱：将激发光的光源用单色器分光，测定不同波长照射下所发射的荧光强度（F），以F做纵坐标，激发光波长λ做横坐标作图。激发光谱反映了激发光波长与荧光强

6、度之间的关系。激发光谱和荧光光谱荧光光谱：固定激发光波长，让物质发射的荧光通过单色器，测定不同波长的荧光强度，以荧光强度F做纵坐标，荧光波长λ做横坐标作图。荧光光谱反映了发射的荧光波长与荧光强度的关系。激发光谱与紫外及荧光光谱的关系激发光谱与紫外吸收光谱激发光谱与荧光光谱小结：去活过程和荧光、磷光的产生体系跨越基态单重激发态三重态荧光磷光物质分子结构与荧光的关系发射荧光的物质应同时具备以下两个条件：物质分子必须具有能够吸收紫外或可见光的结构，并且能产生ππ*或nπ*跃迁。荧光物质必须有较高的荧光量子产率。发射荧光量子数吸

7、收激发光量子数荧光量子产率=有机化合物分子结构与荧光的关系：共轭结构：凡是能提高π电子共轭度的结构，都会增大荧光强度，并使荧光光谱长移。苯萘蒽有机化合物分子结构与荧光的关系：刚性平面：分子的刚性及共平面性越大,荧光量子产率就越大。荧光素酚酞取代基：在芳香化合物的芳香环上，进行不同基团的取代，对该化合物的荧光强度和荧光光谱都会产生影响。环境对荧光的影响温度温度升高分子间碰撞次数增加分子内能转化加速荧光强度降低环境对荧光的影响溶剂及其极性溶剂粘度下降含有重原子的溶剂溶剂分子与溶质形成稳定氢键pH值的影响：当荧光物质本身是弱酸

8、或弱碱时，溶液pH值对该物质荧光强度有较大影响。pH<2无荧光7～12蓝色荧光>13无荧光荧光熄灭：荧光分子与溶剂分子或其它溶质分子的相互作用引起荧光强度降低的现象。荧光熄灭剂：荧光的定量分析F=ΦfIa（1）I0IFIa荧光的定量分析F=φf∙Ia，Ia=I0-II/I0=10-εbcI=I0·10-εbcIa=I