《分子荧光光度法》PPT课件

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1、分子荧光光度法第一节概述一、光致发光物质分子吸收特定波长的光能后，由基态跃迁至激发态。处于激发态的物质分子是不稳定的，可能通过辐射（发光）或非辐射的形式放出多余的能量，由激发态重新回到基态。物质分子吸收外来光被激发后所产生的发光现象，叫光致发光。荧光10-9~10-6s实用磷光10-3~10s不实用二、荧光光度法利用测量荧光强度而建立起来的一类测定物质含量的分析方法，称为荧光光度法，即荧光法。优点：灵敏度高，10-7~10-9g/ml，比紫外分光光度法灵敏度高10~1000倍。第二节基本原理一、荧光的产生基态激发光激发态去激

2、发基态（一）激发处于基态的物质分子吸收光能时，其电子对中的一个电子被激发到某一较高能级。基态单重态所有电子都自旋配对的分子电子态。激发态激发单重态S1S2……激发三重态T1T2……(二)去激发指分子中处于激发态的电子以辐射或非辐射方式回到基态的过程。辐射跃迁荧光去激发磷光振动驰豫无辐射跃迁内转移（热的形式）体系间跨越外转移1、振动驰豫同一电子能级中，电子由高振动能级跃迁到低振动能级，并将能量以热的形式传递给溶剂分子，这一过程称振动驰豫。2、内转移两个相邻电子能级相距较近，以致其振能级重叠时，电子由高电子能级跃迁至低电子能级，

3、同时将能量以热的形式传递给溶剂分子。意义：无论分子中的电子最初被激发至哪一激发单重态（如S1、S2、S3……)，它都能通过内转移和振动驰豫到达S1的最低振动能级上。一般情况下，S1与S0之间很难发生内转移；T1与S0之间发生内转移的几率要大些。3、体系间跨越电子由激发单重态向激发三重态的无辐射跃迁称为体系间跨越。常见于含重原子(I、Br)的有机分子中。4、外转移激发态分子与溶剂分子或其它溶质相互作用，以热的形式失去多余的能量回到基态，这一过程叫分子的外转移。外转移后，分子的荧光或磷光减弱或消失，称“猝灭”或“熄灭”。磷光寿命

4、长，发生外转移机率大，所以室温下很难见到磷光。5、荧光发射电子由第一激发单重态S1（最低振动能级）跃迁至基态S0而发射的光叫荧光。6、磷光发射电子由第一激发三重态T1跃迁至基态S0而发射的光叫磷光。跃迁方式时间振动驰豫10-12~10-14S内转移10-11~10-13S荧光10-6~10-9S磷光10-4~10S二、影响荧光的因素荧光效率：ψf=发射荧光的分子数被激发的分子总数荧光效率越大，表示分子产生荧光的能力越强。1、分子结构(1)π→π*跃迁能产生较强荧光。——产生荧光的主要跃迁类型(2)含π-π共轭体系的有机分子，

5、电子共轭程度越大，荧光效率越大。(3)刚性结构和共平面效应：随分子的刚性和共平面性增加，电子共轭程度亦增加，荧光效率增大。(4)取代基效应：斥电子基→ψf↑吸电子基→ψf↓重原子→ψf↓2、环境因素(1)温度温度↑→荧光效率↓(2)溶剂极性↑→荧光↑(3)溶液pH值影响荧光物质存在形式。因此要严格控制溶液pH值。(4)荧光熄灭剂（卤素离子、重金属离子等等）3、荧光物质浓度自熄灭：当荧光物质高到一定浓度时，荧光分子间碰撞增多，使荧光强度减弱的现象。原理图荧光测量应在垂直激发光方向上进行。一、光源特点：光强度大，适用范围宽。常用

6、：高压汞灯，氙灯，溴钨灯，激光，脉冲激光二、单色器干涉滤光片，光栅三、样品池石英杯四、检测器光电倍增管第三节荧光光度计日立850型荧光分光光度计第四节定量分析方法原理：一定条件下，荧光强度（If)与浓度(c)呈线性关系。If=Kc定量分析的依据方法：标准曲线法和标准对比法第五节分析条件的选择线性范围、激发光波长、荧光波长、散射光的排除一、线性范围的选择荧光物质浓度较低时，荧光强度与物质浓度呈线性关系。二、选择激发波长和荧光波长1、激发波长的选择激发光谱：将光源发射的激发光用单色器单色后照射物质，连续改变激发光波长，固定荧光发

7、射波长，测定相应的荧光强度，所得荧光强度-激发波长图谱，称激发光谱。一般选择最大激发波长作为激发光波长。2、荧光波长的选择荧光光谱：用最大激发波长的激发光照射荧光物质时，依次测定所发射的各波长的荧光强度，所得荧光强度-荧光波长图谱，称为荧光光谱。一般选择荧光强度最强的波长作为测定波长。三、散射光干扰的排除1、散射光当用一束光照射溶液时，大部分光被吸收和透过，还有小部分被溶剂分子碰撞而向四面八方散射，这种光称散射光。瑞利散射光波长与激发光波长一样拉曼散射光波长比激发光波长长2、消除方法（1）选择适宜的激发光波长用不同波长的激发

8、光照射某一荧光物质，所产生的荧光峰位波长相同，但产生的拉曼散射光峰位各不相同。所以，可通过选择某一适宜的激发波长，使产生的拉曼散射光峰位远离荧光峰位而不干扰。（2）选择合适的溶剂拉曼散射光主要来源于溶剂。不同溶剂产生的拉曼散射光波长不同，所以，通过选择不同溶剂使散射光波长远离荧光波长，而消