荧光分光光度法与检测技术.ppt

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1、1第八章荧光分析法检测技术及应用◆学习目的⊙◆知识要求⊙◆能力要求⊙2◆学习目的通过学习荧光分析法的基本原理，产生荧光的条件以及荧光光谱特征和用途，加深对荧光分析的依据、条件和应用的理解，并能选择荧光物质的激发波长和荧光波长进行分析。为学习药物分析、天然药物化学等专业课程奠定基础。3◆知识要求熟悉掌握荧光和磷光产生的原理和特点及区别；激发光谱与荧光光谱的概念及用途；溶液荧光光谱的特征；产生荧光的条件；荧光定量分析的依据、条件和方法。了解。了解影响荧光强度的因素，荧光分析仪器及其与紫外-可见分光光度计的区别，荧光分析新技术在分析中的应用。4◆能力要求掌握荧光分光光度计的基本结构及仪器

2、的基本操作方法，学会使用荧光分光光度计对药物进行分析的操作技术。5第一节荧光分光光度法的基本原理某些物质吸收紫外-可见光后，可以发射其波长比吸收光更长的光，并且随照射光的消失而消失，这种发射光称为荧光（fluorescence）。荧光分析法（fluorometry）是利用某些物质发射荧光的特性进行定性、定量分析的光学分析方法，又称荧光光谱法6第一节基本原理一、荧光的产生过程（一）单重态与三重态A单重基态B激发单重态C激发三重态7第一节基本原理（二）荧光的产生电子由激发单重态→基态单重态的跃迁8第一节基本原理（二）磷光的产生电子由激发三重态→基态单重态的跃迁课堂互动您能比较荧光和磷光

3、的主要区别吗？9第一节基本原理二、激发光谱和荧光光谱（发射光谱）10第一节基本原理任何荧光物质都具有两个特征光谱：激发光谱和荧光光谱（发射光谱）激发光谱是当荧光波长一定时，荧光强度随激发光波长而变化的关系曲线（以激发光波长λex为横坐标，荧光的发光强度F为纵坐标的光谱）。11第一节基本原理荧光光谱是当使激发光波长和强度不变，而让物质所产生的荧光通过发射分光系统(II)分光，测定每一发射波长荧光强度F，以发射光波长λem为横坐标，荧光的发光强度F为纵坐标作图所得的关系曲线。12第一节基本原理溶液荧光光谱具有如下特征：斯托克斯位移荧光光谱的形状与激发波长无关荧光光谱与激发光谱的镜像关系

4、蒽的激发光谱（虚）和荧光光谱（实）13第一节基本原理三、荧光与分子结构（一）荧光物质的特征具有强的可见-紫外吸收，即具有K带强吸收具有高的荧光效率荧光效率14第一节基本原理（二）分子结构与荧光的关系大的共轭π键结构λex（激发）λem（激发）φF苯2052780.11萘2863210.29蒽3654000.46四苯3904800.6015第一节基本原理分子的刚性和共平面性取代基的影响联苯φF=0.18芴F=1.016第一节基本原理（三）影响荧光强度的外界因素温度溶剂溶液酸碱性荧光熄灭剂散射光激发光源17第一节基本原理（四）荧光分光光度计荧光分光光度计是用于扫描液相荧光标记物所发出的

5、荧光光谱的一种仪器。其能提供包括激发光谱、发射光谱以及荧光强度、量子产率、荧光寿命、荧光偏振等许多物理参数,从各个角度反映了分子的成键和结构情况。18第一节基本原理（一）仪器类型滤光片荧光计滤光片-单色器荧光计荧光分光光度计19第一节基本原理（二）荧光分光光度计的基本结构1.光源2.4.7.9.狭缝3.激发单色器5.样品池6.表面吸光物质8.发射单色器10.检测器11.放大器12.指示器13.记录器20第一节基本原理光源目前最常用的是氙灯单色器（分光系统）激发单色器发射单色器样品池测定荧光用的样品池必须用低荧光材料或石英检测器光电倍增管21第一节基本原理（三）仪器校准灵敏度校准波长

6、校准激发光谱和发射光谱校准22课堂互动请您比较荧光分光光度计与紫外-可见分光光度计的主要区别第一节基本原理23点滴积累荧光和磷光在实验现象上的区别：激发光停止照射时，荧光随之消失而磷光则将延续一段时间。最强荧光波长λem和最强激发波长λex是物质的定性依据，也是定量测定时的最适宜波长。强荧光物质的分子结构体征：一、具有长共轭结构，如芳香环、稠环或杂环；二、刚性和共平面性。影响荧光强度的主要因素是分子结构与外界条件。第一节基本原理第二节荧光定量分析第二节荧光定量分析由于荧光物质的结构不同，其吸收光的波长不同，发射出荧光的波长也不同，这就是荧光分光光度法对能产生荧光的物质进行定性分析的

7、依据。实验证明，在稀溶液中，荧光强度与荧光物质的浓度成正比，这是荧光分光光度法对荧光物质进行定量分析的依据。24第二节荧光定量分析一、荧光强度与物质浓度的关系当溶液中荧光物质的浓度为c，液层厚度为（吸收池内径）L时，由于荧光强度F正比于被荧光物质吸收光的强度：F∝（I0–I），用线性方程表示为：F=K′（I0–I）25第二节荧光定量分析K′为常数，称荧光比率，其大小取决于一定条件下的荧光效率，结合比尔定律可得到下式：F=2.303·φF·I0·ε·c·L入射光强度I0