植物细胞荧光检测技术

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1、植物细胞荧光检测技术前言：细胞荧光检测技术比一般光学检测技术具有灵敏度高、特异性强和测定快速等优点，因此近年来荧光组织化学，特别是免疫荧光技术有了很大的发展。当用一种波长的光（如紫外光）照射某种物质时，这个物质会在极短的时间内，发射出较照射波长更长的光（如可见光），这种光就称为荧光。若发射的光的波长较荧光的长，即为磷光。有些生物体受到紫外线的照射后，能直接发出荧光，如叶绿素的红色荧光、木质素的黄色荧光等，通称为自发荧光或直接荧光。有的生物材料受紫外线照射后并不发光，但当它结合荧光染料后，也同样产生荧光，这种荧光称为间接荧光或次生荧光。除少数生活物质含有自

2、发荧光外，大多数研究，需外加荧光染料，进行特异性的显示，因此生物荧光色素的选择和研制是荧光细胞化学特别重要的一环。荧光素是用于荧光检测技术的的经典的荧光染料，可用紫外光（小于400nm）或蓝光（常为490nm）激发，然后发射出绿色荧光（500~550nm），其波长范围正是暗适应时眼睛最敏感的范围。化学反应活性很好的异硫氰酸荧光素（FITC）容易与抗体相连接，是常用的免疫荧光染料。这类二抗可从供应商那里买到。罗丹明、伊红、四甲基罗丹明、Texas 红是一组相关的荧光染料，它们的激发光波长为 520~590nm，发射光波长为 550~620nm。它们可以通过

3、一个异硫氰酸侧基与抗体相连结。DAPI是用于荧光标记双链DNA 最常用的荧光染料。DAPI与AT 碱基结合后其荧光比处于溶液中的自由状态或与GC碱基结合的荧光强约 20 倍。因此常用于显示细胞核和染色体。DAPI可用 330~430nm的光激发，发射出 400~500nm的光，主要是绿光，红光很弱。DAPI的一个不足是在多色成像时当用360nm 的光激发时，DAPI发射的光太亮从而掩盖了其他的荧光信号，降低DAPI信号强度的一个简单方法是用405nm的光代替 360nm的光作激发光。长波长的光不能很好的激发DAPI，但对细胞的光损害减少了（活细胞时尤为重

4、要），而且也减少了对其他荧光染料的光漂白作用。荧光素、罗丹明和DAPI常用于标准荧光显微镜而且匹配得很好。近年来又发展了新的用于荧光显微术的荧光染料。MolecularProbes 和Amersham 公司分别开发出一些新的染料，如：TMBODIPY 和花菁染料。这些新的荧光染料可以代替荧光素和罗丹明，且在多探针实验中光谱特性更好些。YOYO家族（MolecularProbes）是一系列有多种色彩的 DNA结合染料，比用于显微术的 DAPI和 DNA凝胶染色的溴乙锭还要灵敏得多。然而，由于 DAPI在普通用途中有足够的明亮度，故仍是标准的DNA 荧光染料

5、。本节介绍几种细胞组分的荧光标记方法及研究胞间连丝通透性的荧光探针法。一植物肌动蛋白细胞骨架的荧光标记（一）原理细胞骨架是由中间纤维、肌动蛋白丝和微管等一系列丝状结构所组成。研究肌动蛋白细胞骨架组分常用的方法是免疫荧光染色和使用从蘑菇中提取的鬼笔环肽（phalloidin 或phallacidin）连接荧光标记物来进行标记。鬼笔环肽可以用不同的荧光素标记，选择哪一种荧光素取决于鬼笔环肽标记肌动蛋白是否是作为双标记的一部分。在大多数细胞内，丰富的肌动蛋白丝将提供一个很强的信号，在双标记实验中，选择荧光素时应考虑到这一点。一般来说，罗丹明标记更能抵抗光致漂白

6、，故可用于暴露时间较长的精细结构的研究。本实验用 TRITCphalloidin标记细胞骨架的 F肌动蛋白。（二）材料与设备1．植物材料百合花粉2．仪器设备荧光显微镜或共聚焦激光显微镜、培养皿、镊子、载玻片盖玻片等。3．试剂：(1).花粉萌发液：15%蔗糖0.01%硝酸钾0.02%硫酸镁0.01%硼酸0.03%硝酸钙pH 5.6.50mmol Pipes 缓冲液。(2).3.7%多聚甲醛固定液（用 50mmol Pipes 配制）。(3) pH 7.4 磷酸缓冲液（PBS）。(4) 1mM TRITCphalloidin (用 PBS配制，内含 1%DM

7、SO)（三）实验步骤(1)收集百合花粉，4℃下水合，在花粉萌发液中 26C黑暗摇床培养，转速60 转/分。(2)萌发 1.5 小时后，花粉管长约100200um, 在小离心管中自发沉降。去培养液(3)在3.7%的多聚甲醛固定液中 25℃下，固定1 小时，固定的同时抽气 10分钟。(4)用 PBS洗涤固定的细胞 3 次，每次 5 分钟。(5)将细胞在 1mmol 的 TRITCphalloidin溶液中标记1 小时，不加清洗，滴 50%甘油（含抗荧光衰退剂），指甲油封片。（四）实验结果：用荧光显微镜或共聚焦激光显微镜观察，激发光为绿光。二核酸的荧光标记（一

8、）原理很多荧光染料可以用于细胞核DNA 的标记和定量。常用的荧光染料如Hoech