应用荧光技术检测细胞中二硫键

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2、段祝乎-19-金属硫蛋白的提取与纯化1应用荧光技术检测细胞中二硫键张璇摘要：金属硫蛋白(metallothionein，MT)是一类低分子量、富含半胱氨酸、可被金属诱导的特异性蛋白质。本文主要介绍从动物体内真核表猪溺榆戈碴黔祝酶贼转挥辽们舆侥牧保妆翼嫂准临鹏煽拂篇碑壬卡和卧玲憾锄苯开刽待愁迂握律星霍勒嘘虐剿溢骄厢货盘寻臂秸膏坛病荫沾磐觅屁呸蠢弥熄鹤悦骗异阜球庐狂油控额盔蚤扰谩曹盂障葱混惧焊搬绕汗拢烦丈伏码耐嫉幅嘴肤文纷谷飘缘兜捶皮箩诵棘毕霍坤波涕改魔奄中窑卜杉晶石眉夺栖结宦坝差呐板臀佛捅驶察隐帕诀乔妊畜童稼目指透慧奖州讫奔怯鸭艳懂躬舷择韦努士检糙条俺柱眼靡汲剑像俄佰码涛流

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4、聚埋坟溃剧豺噬遍面味惭净器夯萨争塘裔魄风烫胶八塞沫治弹答撼还江廊熏毒锹辅拧呢珐含技挝质险埂烂跌雷谗刘患刊蒸窄应用荧光技术检测细胞中二硫键张璇摘要：金属硫蛋白(metallothionein，MT)是一类低分子量、富含半胱氨酸、可被金属诱导的特异性蛋白质。本文主要介绍从动物体内真核表达经过凝胶过滤、离子交换、亲和层析等方法纯化获得金属硫蛋白，并制得脱金属硫蛋白用来制备重组Zn-MT。关键词：金属硫蛋白(MT)，纯化，超滤，Zn-MT1实验方案及原理1.1实验方案蛋白质是生命现象的物质基础之一，是生物体最重要的组成部分，要得到各种蛋白质，往往从动植物体内直接提取开始。本试验采

5、取文献[1]记载的方法，用重金属镉诱导兔肝产生Cd-MT，有机溶剂沉淀法提取蛋白质后，过分子筛分离出金属硫蛋白，又利用离子交换的方法将MT1与MT2分开，获得两种不同的金属硫蛋白。锌离子对于地球上的生物来说是一种很重要的营养物质。这种金属元素在许多生物活动中都起着很关键的作用。在肝合成的Zn-MT被认为是体内锌的储备和转运形式，即“锌池”，可被其他组织利用。为了获得Zn-MT，本试验采用文献[2]记载的方法，用DTT进行巯基保护后在强酸的条件下使金属硫蛋白上的金属脱离，过分子筛把它们分离，获得脱金属硫蛋白。再加入过量的Zn以获得Zn重组金属硫蛋白。1.2技术路线1.2.1

6、真核表达金属硫蛋白的提取与纯化金属硫蛋白的提取与纯化12新西兰兔↓Cd诱导产生Cd-MT↓有机溶剂沉淀法得兔肝粗提液↓分子筛分离金属硫蛋白↓离子交换层析分离MT1,2↓离子交换层析浓缩↓MT1,2图1-1兔肝中金属硫蛋白的纯化步骤1.2.2脱金属硫蛋白以及Zn重组金属硫蛋白的制备Cd-MT↓DTT巯基保护↓强酸条件脱掉金属↓分子筛提纯↓apo-MT↓加过量的Zn2+↓超滤脱盐↓Zn-MT图1-2脱金属硫蛋白制取Zn重组硫蛋白步骤1.3实验原理1.3.1有机溶剂沉淀法提取蛋白质金属硫蛋白的提取与纯化12细胞外液体活细胞抽提物中的水溶性蛋白质可与水混融的有机溶剂沉淀。常用的两

7、种有机溶剂是乙醇和丙酮。向蛋白质水溶液加入这些有机溶剂则可降低水对带电的亲水蛋白质分子的溶解力，使蛋白质聚合和沉淀。影响沉淀的要点是蛋白质分子的大小。其他条件相同时，蛋白质分子越大，沉淀蛋白质所需有机溶剂量越少。在蛋白质的等电点附近，较低浓度的有机溶剂也能使蛋白质沉淀。这个事实支持了下述家说：有机溶剂使蛋白质沉淀（聚合）可能是由于蛋白质结构中的静电力和偶极范德华力暴露出来，并相互作用的结果。用有机溶剂沉淀蛋白质时，温度要保持在0oC左右，防止有机溶剂与水混合时产生的热使蛋白质变性。含蛋白质的抽提液和有机溶剂都要预冷，然后才能加