叶绿素荧光分析技术与应用.ppt

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1、叶绿素荧光分析技术与应用1931年，Kautsky和Hirsch第一次用肉眼发现叶绿素荧光动力学现象（Kautskyeffect）距今已有80多年，但把叶绿素荧光动力学作为一种技术应用于光合作用的研究中则是近20年的事。叶绿素荧光动力学技术在测定叶片光合作用过程中光系统对光能的吸收、传递、耗散、分配等方面具有独特的作用，与“表观性”的气体交换指标相比，叶绿素荧光参数更具有反映“内在性”特点。因此，叶绿素荧光动力学技术被称为测定叶片光合功能快速、无损的探针，并广泛应用于植物生理学、生态学和农业科学研究中。基本概念：绿色植物或含叶绿素的部分组织在黑暗中适应片刻或用近

2、红外光预照射，然后在可见光下激发，并用荧光仪检测，会发现植物绿色组织发出一种微弱的暗红色的、强度随时间不断变化的荧光信号，这个过程称为叶绿素a荧光诱导动力学，简称为叶绿素荧光动力学。荧光来源：由于叶绿素分子吸收的光能有一部分消耗于分子内部振动上，辐射出的能量就小，根据波长与分子能量成反比的规律(E=hv2)，反射光的波长比入射光的波长要长一些。所以叶绿素溶液在入射光下呈绿色，而在反射光下呈红色。绝大部分植物体内叶绿素荧光来自PSII的天线色素系统，而PSI色素系统基本不产生荧光。荧光来源：叶绿素分子吸收量子后，由最稳定的、最低能量的基态（常态）提高到一个不稳定的

3、、高能状态的激发态。由于激发态不稳定，迅速向较低能态转变，能量有的以热量的形式散失，有的以光形式散失。从第一单线态回到基态所发射的光就成为荧光。荧光的寿命很短，约为10-8－10-9s。光合电子传递的”Z图”激发能光化学反应形成同化力热耗散荧光荧光测量基础：植物叶片所吸收的光能有3个走向：光合驱动、热能、叶绿素荧光。3个过程之间存在竞争，其中任何一个效率的增加都将造成另外两个产量的下降。测量叶绿素荧光产量，可以获得光化学过程与热耗散效率的变化信息。CO2固定光呼吸Mehler反应N代谢荧光是研究光能分配的探针叶绿素荧光：植物吸收的一小部分光重新以光的形式发射出来

4、P+D+F=1F=1-P-D光化学的和耗散性的荧光淬灭(F)(D)(P)活体叶绿素荧光是光合作用的有效探针活体状态下，叶绿素荧光几乎全部来源于PSII的Chla（包括天线Chla），活体叶绿素荧光提供的快速信息仅仅反映了PSII对激发能的利用和耗散情况光合作用过程的各个步骤密切偶联，因此任何一步的变化都会影响到PSII从而引起荧光变化，也就是说通过叶绿素荧光几乎可以探测所有光合作用过程的变化尽管叶绿素荧光产量仅占叶片吸收光能问题的1－2%，但测量却非常简单。荧光光谱不同于吸收光谱，其波长更长，因此荧光测量可以通过把叶片经过给定波长的光线的照射，同时测量发射光中波

5、长较长的部分光线的量来实现。叶绿素荧光测量是相对的，因为光线不可避免会有损失，因此，所有分析必须把数据进行标准化处理，包括进一步计算的许多参数。将绿色植物或含叶绿素的部分组织，如叶片、芽、嫩枝条、茎或单细胞藻类悬液放在暗中适应片别，或用近红外光预照射，然后在可见光下激发，并用荧光计检测，结果就会发现植物绿色组织会发出一种微弱的暗红色强度随时间不断变化的荧光信号，这过程称为植物体内叶绿素a荧光诱导动力学，简称为叶绿素荧光动力学。绝大部分是来自叶绿体光系统II(PSII)的天线色素蛋白复合体中的叶绿素a分子，荧光发射波长范围约在650－780nm，荧光发射峰在685

6、nm和735nm，其荧光激发光谱与叶绿体的吸收光谱近似，荧光激发峰在438nm与480nm左右。根据现在国际上的统一命名，可把荧光诱导曲线划分为：O(原点)→I(偏转)→D(小坑)或pl(台阶)→P(最高峰)→S(半稳态)→M(次峰)→T(终点)这几个相(phase)。有时在O和I之间还可辨认出一个扔点称为J相。其中O→P相为荧光快速上升阶段(1－2s)，从P→T为荧光慢速下降(猝灭)阶段(4－5s），在此阶段，往往出现复杂的情况，有时没有M峰，有时出现几个渐次降低的峰，因叶片的生理状态不同而异。一般而言，遭受环境胁迫的叶片M峰消失，而生理状态良好的叶片往往在P

7、峰之后有几个峰出现。这可能反映了同化力形成和使用之间从不平衡到平衡的一个快速的调节过程。叶绿素荧光诱导动力学OIDPSMT曲线经暗适应的绿色植物样品突然受到可见光照射时，体内叶绿素分子可在纳秒(ns)级时间内发出一定强度的荧光，此瞬时的荧光诱导相位称为初相或“O”相，此时的荧光称为固定荧光(Fo)，然后荧光强度增加的速度减慢，因而在Fo处形成拐点，接着以毫秒级速度形成一个缓台阶，称为“I”相和“D”相，数秒后荧光强度可达最高点，称为“P”峰。若所用激发光强度达到或超过被测样品光反应的光饱和点时，P峰即趋于或等于最大荧光(Fm)。荧光强度超过Fo那一部分的荧光称为

8、可变荧光(Fv)。在P峰