实验五小鼠初级精母细胞染色体畸变试验

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1、实验五小鼠初级精母细胞染色体畸变试验MammalianSpermatocyteChromosomeAberrationTest目的本试验是一项检测生殖细胞染色体畸变效应试验，利用细胞遗传学方法，检测整体哺乳动物初级精母细胞染色体畸变，以评价受试样品引起生殖细胞可遗传突变的可能性。学习小鼠初级精母细胞染色体畸变试验方法的基本操作步骤。原理不同发育阶段的雄性生殖细胞对化学物质的敏感性不同，初级精母细胞对化学诱变剂较敏感。多数情况下，化学诱变剂诱发染色体畸变必须经过DNA复制期。哺乳动物精子发生过程中，DNA合成是在初级精母

2、细胞细线期以前的各阶段细胞中进行，以后孵育的细胞不再进行DNA合成，故受试物需在前细线期给予。于小鼠第一次接触受试物后的第12～14天采样制片，可观察到前细线期接触引起的精母细胞染色体畸变效应。仪器和器械生物显微镜、离心机、解剖剪、眼科镊子、注射器、灌胃针头、小平皿、离心管、吸管、滴管、试管架、载玻片、玻璃染色缸、擦镜纸等。试剂姬姆萨（Giemsa）染液Giemsa染料3.8g甲醇375ml甘油125ml配制：将Giemsa染料和少量甲醇于乳钵里仔细研磨，再加入甲醇至375ml，待完全溶解后，再加入125ml甘油，混合

3、均匀。置37℃恒温箱中保温48h。保温期间振摇数次，促使染料的充分溶解。取出过滤，两周后使用。试剂0.04%秋水仙素：置于棕色瓶中，冰箱保存;低渗液：1%柠檬酸三钠溶液;1%枸橼酸三钠溶液；0.4％KCL,300ml60%冰乙酸:临用时现配,100ml固定液:甲醇与冰醋酸以3:1混合，临用时现配,400ml;试剂磷酸盐缓冲液（pH6.8）12水磷酸氢二钠（Na2HPO4）11.81g（磷酸氢二钠：4.74g）磷酸二氢钾（KH2PO4）4.50g加蒸馏水至1000mlGiemsa应用液:取1份Giemsa染液与9份1/1

4、5mol/L磷酸盐缓冲液混合而成，临用时配制。试验设计实验动物7～12周龄健康雄性小鼠，每组保证至少5只存活剂量分组阴性对照组溶剂阳性对照组丝裂霉素C1.5～2mg/kg腹腔注射一次；或环磷酰胺40mg/kg，腹腔注射，1次/d，连续5天。试验设计－剂量组高剂量根据急性LD50，选用使动物轻微中毒，体重略有下降，不引起动物死亡的剂量按等比级数2向下设置中、低剂量组接触途经与实际接触途经一致或接近，可一次接触，也可每天接触一次，连续5天的方法。取样时间各组均于第一次接触后第12～14天将动物处死采样。操作步骤1、注射秋水

5、仙碱动物处死前6h腹腔注射秋水仙碱4mg/kg（0.04％，0.1ml/10g）2、动物处死颈椎脱臼处死小鼠，取两侧睾丸，去净周围组织和脂肪，放入盛有适量低渗液的小平皿中，洗去毛和血污，转入另一小平皿中。3、低渗用眼科镊撕开睾丸被膜，轻轻分离曲细精管，加低渗液10mL，用滴管吹打混悬曲细精管，室温下低渗20～40min（低渗时间依室温条件而定）。4、固定仔细吸净低渗液，加固定液10mL，固定20min。必要时可存放在冰箱中过夜，但软化前应将固定液吸掉，再加入新鲜固定液，固定10min。5、软化吸净固定液，加60％冰醋酸

6、2mL，滴管吹打至不透光，立即加入4mL固定液，用滴管打匀，移入离心管，以1000r/min离心10min。6、制片弃去大部分上清液，留下约0.5～1mL，充分打匀制成细胞悬液。将细胞悬液均匀地滴于冰水玻片上，轻吹细胞悬液扩散平铺于玻片上。每个睾丸制片2～3张。空气干燥或微热烘干。预冷的玻片滴片7、染色将制备好的标本片放入Giemsa应用液中染色20～30min。立即用蒸馏水或磷酸盐缓冲液冲洗。晾干。8、读片在低倍镜下按一定顺序寻找背景清晰、分散良好、染色体收缩适中的中期分裂相细胞，再在油镜下选取邻近无游离染色体或中期

7、相的细胞进行观察。9．观察每只动物分析100个中期分裂相细胞。（1）裂隙、断片、缺失、微小体、环状染色体、整倍体和非整倍体改变等。（2）相互易位涉及非同源染色体间末端断片的交换，需要两次断裂和修复。（3）X-Y和常染色体的单价体统计学方法：受试样品组与对照组的断片、易位、畸变细胞率、常染色体单价体、性染色体单价体等分别按X2检验或Kastenbaum和Bowman所述方法进行统计分析。阳性：受试样品组染色体畸变率与阴性对照组相比，统计学意义上有显著性差异，并有明显的剂量—反应关系或在一个受试样品组出现染色体细胞畸变数明

8、显增高。若统计学上差异有显著性，但无剂量—反应关系，则须进行重复试验，结果能重复者可确定为阳性。结果评价小白鼠的染色体分裂相（2n＝40）小白鼠的染色体