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1、实验十染色体畸变试验可用末梢血淋巴细胞，或人和哺乳动物体细胞系作为材料，常用的体细胞系有中国地鼠卵巢细胞（CHO）,中国地鼠肺成纤维细胞（V?9和CHL）,人胚肺2倍体成纤维细胞等。这里介绍外周血淋巴细胞为对彖的染色体畸变的试验方法。1.实验原理外周血中小淋巴细胞儿乎都处在细胞增殖周期的$期或Go期（不同于体外培养的体细胞），一般条件下是不会再分裂的。当在培养物中加入适量的PHA,在37°C下，经52〜72h的培养，淋巴细胞开始转化，进入细胞增殖周期，此时町获得大量的冇丝分裂的细胞。再经过秋水仙素处理，低渗、固定
2、，即可在显微镜下观察到良好的中期染色体分裂相。电离辐射,化学有害物质作用于机体或体外细胞，均可引起细胞染色体的损伤，且与剂量（浓度）呈良好的线性关系。因此，染色体畸变已用于电力辐射事故的牛物计量估算。2.方法与步骤（1）试剂①RPMI-1640培养液，含20%小牛血清。②肝素：每支含肝素12500U,使用时用纶理盐水配成500U/ml,4°C冰箱内保存备用。③秋水仙素：配成40ug/ml浓度。称取秋水仙素4mg,溶解于100ml0.85%Nacl溶液中,经6号细菌漏斗过滤，4°C冰箱内保存。使用时吸取0.05或0
3、.1ml加入到5ml细胞培养物中,其终浓度为0.4〜0.8ug/mlo④双抗：青霉素100U/ml,链霉素lOOug/mL⑤PHA:PHA为冰干注射剂（广州牛产）每支10mg,使用吋用2ml生理盐水溶解。⑥KCI低渗液：KCI1.88g,双蒸水1000ml使Z溶解，其浓度为0.025M.⑦冰醋酸卬醇固定液：冰醋酸1份，卬醇3份，混合而成。（2）细胞培养常规细胞培养。（3）受试物的处理实验分组：至少设立五个组，即阳性对照、阴性（溶剂）对照及三个剂量组。最高剂量和最低剂量之间相差10倍，中间再设一个剂量，阳性对照物为
4、己知的染色体断裂剂，如丝裂得素C（MMC）,剂量为0.02ug/ml；黄曲得素毒素B1,浓度为10'6M等。每组中应设2〜3个平行样品。（4）操作步骤①收集细胞：经受试验处理的细胞，培养开始后52〜72h收集细胞。依不同受试物而有所差异。②加入秋水仙素：培养终止前于培养物中加入40Hg/ml秋水仙素0.05-0.1ml,终浓度为0.4〜0.8ug/ml,37°C下培养4h。③低渗处理：小心取出细胞培养物，弃去上清液，细胞沉淀在瓶底（体细胞须经胰酶消化），加入8mlKCI低渗液,用滴管轻轻吹打制成细胞悬液,移入10
5、ml刻度离心管中,37°C卜-处理20mino④离心:1000转/min,离心7〜lOmin,弃去上清液,收集细胞,加入Hanks液。⑤固定：加入1：3冰醋酸甲醉固定液3ml预固定，用滴管轻轻吹打，立即离心，收集细胞，再加入10ml±述固定液，处理15min,反复操作两次，每次15min«⑥制片：弃去固定液，再加入适量新鲜固定液，混匀。収出预冷的载玻片，每片滴加1〜2滴细胞悬液，用嘴轻轻吹散，或用滴管吸取少许细胞悬液，在40〜50cm高度上对准下而玻片滴加悬液，以冲力使细胞分散。自然干燥或用微热电吹风机吹干，也可
6、在酒精灯火焰上略加烘烤。此时可在显微镜下检杏冇无分裂相细胞。⑦染色：用Giemsa染液染色15min,用白來水轻轻冲洗残留染液，待T。⑧镜检：先在低倍镜下寻找分散良好的分裂相细胞，然后用高倍镜或目镜观察，进行染色体畸变计数，分析，分別记录染色体畸变细胞数及各种类型染色休畸变细胞数，选择良好的典型的染色体畸变图进行显微照相。（5）结果表不①染色体总畸变率及畸变率：总畸变率（％）二各种畸变类型数/分析总细胞数X100畸变率（％八染色体畸变数/染色体总数X100②畸变类型分析：包括断片（F）、双着丝粒（D）、环（R）、
7、互换（E）等，电力辐射常见断片、双着丝粒、环等，而化学毒物常见单体断裂。（6）注意事项①接种的血样要新鲜，如不立即培养，应放在4〜25°C温度下，于24h内作培养。②培养箱温度以37±5°C为宜。③培养过程中如发现血样凝集，可将培养瓶轻轻震荡，使凝块散开,然后继续培养。④如低渗处理不当，染色体聚集一团，可将固定时间延长数小时或过夜，热低渗过度,往往细胞全部破碎，造成染色体丢失。⑤离心速度过快，细胞团不易打散，速度过低，则使分裂相细胞大量丢失。⑥玻片耍严格清洁，使细胞均匀铺开。14212210J5XX人类染色体图谱
