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时间:2018-07-08
《体外哺乳动物细胞染色体畸变试验》由会员上传分享,免费在线阅读,更多相关内容在行业资料-天天文库。
1、九、体外哺乳动物细胞染色体畸变试验InVitroMammalianCellsChromosomeAberrationTest1范围本规范规定了体外哺乳动物细胞染色体畸变试验的基本原则、要求和方法。本规范适用于检测化妆品原料及其产品的致突变性。2规范性引用文件OECDGuidelinesforTestingofChemicals(No.473,July1997)3试验目的本试验是用于检测培养的哺乳动物细胞染色体畸变,以评价受试物致突变的可能性。4定义染色体型畸变(Chromosome-typeaberration):染色体结构损伤,表现为在两个染色单体相同位点均出现断裂或断裂重组的改变
2、。染色单体型畸变(Chromatid-typeaberration):染色体结构损伤,表现为染色单体断裂或染色单体断裂重组的损伤。染色体数目改变(Numericalaberration):所用细胞株的正常染色体数目的变化。结构畸变(Structuralaberration):在细胞分裂的中期相阶段,用显微镜检出的染色体结构改变,表现为缺失、断片、互换等。有丝分裂指数(Mitoticindex):中期相细胞数与所观察的细胞总数之比值;是一项反映细胞增殖程度的指标。5试验基本原则在加入和不加入代谢活化系统的条件下,使培养的哺乳动物细胞暴露于受试物中。用中期分裂相阻断剂(如秋水仙素或秋水仙
3、胺)处理,使细胞停止在中期分裂相,随后收获细胞,制片,染色,分析染色体畸变。6试验方法6.1试剂和受试物制备6.1.1阳性对照物:可根据受试物的性质和结构选择适宜的阳性对照物,阳性对照物应是已知的断裂剂,能引起可检出的、并可重复的阳性结果。当外源性活化系统不存在时,可使用甲磺酸甲酯(methylmethanesulphonate(MMS))、甲磺酸乙酯(ethylmethanesulphonate(EMS))、乙基亚硝基脲(ethylnitrosourea)、丝裂霉素C(mitomycinC)、4-硝基喹啉-N-氧化物(4-nitroquinoline-N-oxide)。当外源性活化
4、系统存在时,可使用苯并(a)芘[benzo(a)pyrene]、环磷酰胺(cyclophosphamide)。6.1.2阴性对照物:应设阴性对照,即仅含和受试物组相同的溶剂,不含受试物,其它处理和受试物组完全相同。此外,如未能证实所选溶剂不具有致突变性,溶剂对照与本实验室空白对照背景资料有明显差异,还应设空白对照。6.1.3受试物6.1.3.1117受试物的配制:固体受试物需溶解或悬浮于溶剂中,用前稀释至适合浓度;液体受试物可以直接加入试验系统和/或用前稀释至适合浓度。受试物应在使用前新鲜配制,否则就必须证实贮存不影响其稳定性。6.1.3.2溶剂的选择:溶剂必须是非致突变物,不与受试
5、物发生化学反应,不影响细胞存活和S9活性。首选溶剂是培养液(不含血清)或水。二甲基亚砜(DMSO)也是常用溶剂,使用时浓度不应大于0.5%。6.1.3.3受试物浓度设置(1)最高浓度的选择:决定最高浓度的因素是细胞毒性、受试物在试验系统中的溶解度以及pH或渗克分子浓度(osmolality)的改变。(2)细胞毒性的确定:应使用指示细胞完整性和生长情况的指标,在活化系统存在或不存在的两种条件下确定细胞毒性,例如细胞覆盖程度(degreeofconfluency)、存活细胞计数(viablecellcounts)或有丝分裂指数(mitoticindex)。应在预试验中确定细胞毒性和溶解度
6、。(3)剂量设置:①至少应设置3个可供分析的浓度。当有细胞毒性时,其浓度范围应包括从最大毒性至几乎无毒性;通常浓度间隔系数不大于2~。②在收获细胞时,最高浓度应能明显降低细胞覆盖程度、细胞计数或有丝分裂指数(均应大于50%)。③对于那些相对无细胞毒性的化合物,最高浓度应是5μl/mL,5mg/mL或0.01mol/L。④对于相对不溶解的物质,当浓度低于不溶解浓度时仍无毒性,则最高剂量应是,当处理期结束时,在最终培养液中溶解度限值以上的一个浓度。在某些情况下(即仅当高于最低不溶解浓度时才发生细胞毒性),应使用一个以上可看见沉淀的浓度。最好在试验处理开始和结束时均评价溶解度,因为由于细胞
7、、S9等的存在,在试验系统内在暴露过程中溶解度可能变化。不溶解性可用肉眼鉴别,但沉淀不能影响观察。6.1.4培养液:采用MEM(Eagle),并加入非必需氨基酸和抗菌素(青、链霉素,按100IU/mL),胎牛血清或小牛血清按10%加入。也可选用其它合适的培养液。6.1.5活化系统通常使用的是S9混合物(S9mix)。S9是从经酶诱导剂(Aroclor1254或苯巴比妥钠和β-萘黄酮联合使用)处理的啮齿动物肝脏获得的。S9的制备同Ames试验。S9的使用浓度
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