体外哺乳动物细胞基因突变试验

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1、十、体外哺乳动物细胞基因突变试验InVitroMammalianCellGeneMutationTest1范围本规范规定了体外哺乳类细胞基因突变试验的基本原则、要求和方法。本规范适用于检测化妆品原料及其产品的致突变性。2规范性引用文件OECDGuidelinesforTestingofChemicals(No.476,1997)3试验目的该测试系统用于检测化妆品原料及其产品引起的突变，包括碱基对突变、移码突变和缺失等，从而评价受试物引起突变的可能性。4定义正向突变（Forwardmutation）：从原型至突变子型的基因突变，这种突变可引起酶和功能蛋白的改变。突变

2、频率（Mutantfrequency）：所观察到的突变细胞数与存活细胞数之比值。5试验原理在加入和不加入代谢活化系统的条件下，使细胞暴露于受试物一定时间，然后将细胞再传代培养，突变细胞在含有6-硫代鸟嘌呤（6-thioguanine，6-TG）或三氟胸苷（trifluorothymidine，TFT）的选择性培养液中能继续分裂并形成集落。基于突变集落数，计算突变频率以评价受试物的致突变性。6试验方法6.1试剂和受试物制备6.1.1受试物6.1.1.1受试物的配制：固体受试物需溶解或悬浮于溶剂中，用前稀释至适合浓度；液体受试物可以直接加入试验系统/或用前稀释至适合浓

3、度。受试物应在使用前新鲜配制，否则就必须证实储存不影响其稳定性。6.1.1.2溶剂的选择：溶剂必须是非致突变物，不与受试物发生化学反应，不影响细胞存活和S9活性。首选溶剂是水或水溶性溶剂。二甲基亚砜（DMSO）也是常用溶剂，但使用时浓度不应大于0.5%。6.1.1.3受试物浓度设置6.1.1.3.1最高浓度的选择：决定最高浓度的因素是细胞毒性、受试物在试验系统中的溶解度以及pH或渗克分子浓度（osmolality）的改变。6.1.1.3.2细胞毒性的确定：应使用指示细胞完整性和生长情况的指标，在活化系统存在或不存在两种条件下确定细胞毒性，例如相对集落形成率或相对细

4、胞总生长情况（totalgrowth）。应在预试验中确定细胞毒性和溶解度。6.1.1.3.3剂量设置121至少应设置4个可供分析的浓度。当有细胞毒性时，其浓度范围应包括从最大毒性至几乎无毒性。通常浓度间隔系数不大于。如最高浓度是基于细胞毒性，那么该浓度组的细胞相对存活率（相对集落形成率）或相对细胞总生长情况应为10%~20%（不低于10%）。对于那些细胞毒性很低的化合物，最高浓度应是5µL/mL,5mg/mL或0.0lmol/L。对于相对不溶解的物质，其最高浓度应达到或超过在细胞培养状态下的溶解度限值。最好在试验处理开始和结束时均评价溶解度，因为由于S9等的存在，

5、试验系统内在暴露过程中溶解度可能发生变化。不溶解性可用肉眼鉴别，但沉淀不应影响观察。6.1.2对照：在每一项试验中，在代谢活化系统存在和不存在的条件下均应设阳性对照和阴性（溶剂）对照。6.1.2.1阳性对照：当使用代谢活化系统时，阳性对照物必须是要求代谢活化、并能引起突变的物质。在没有代谢活化系统时，阳性对照物可使用甲磺酸乙酯（ethylmethanesulfonate-EMS）、甲磺酸甲酯（methylmethanesulphonate，MMS），乙基亚硝基脲（ethylnitrosourea-ENU）等。在有代谢活化系统时，可以使用3-甲基胆蒽（3-methy

6、lcholanthrene）、环磷酰胺（cyclophosphamide）N-亚硝基胍（N-nitroso-dimethylamine）、7,12-二甲基苯蒽等。也可使用其他适宜的阳性对照物。6.1.2.2阴性对照物：阴性对照（包括溶剂对照）除不含受试物外，其他处理应与受试物相同。此外，当不具有实验室历史资料证实所用溶剂无致突变作用和无其他有害作用时，还应设空白对照。6.1.3细胞：HPRT位点突变分析常用中国仓鼠肺细胞株（V-79）和中国仓鼠卵巢细胞株（CHO）。TK位点突变分析常用小鼠淋巴瘤细胞株（L5178Y）和人类淋巴母细胞株（TK6）。6.1.4培养液：

7、应根据实验所用系统和细胞类型来选择适宜的培养基。对于V-79或CHO细胞，常用MEM（Eagle）培养基加入10%胎牛血清和适量抗菌素。对于L5178Y或TK6细胞，常用RPMI1640培养基加入10%马血清和适量抗菌素。6.1.5活化系统：同体外哺乳类细胞染色体畸变试验。6.1.6选择剂：6-硫代鸟嘌呤（6-TG）：建议使用终浓度为5mg/mL。三氟胸苷（TFT）：建议使用终浓度为3mg/mL。6.2试验步骤6.2.1HPRT位点突变分析6.2.1.1试验前1d，接种细胞于培养瓶中，置于37°C孵箱培养。6.2.1.2试验时吸去培养瓶中的培养液，加入一定浓度的受

8、试物、S9