鸡新城疫病毒免疫金标试纸条的研制及其应用

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1、河北农业大学硕士学位论文鸡新城疫病毒免疫金标试纸条的研制及其应用姓名：薛拥志申请学位级别：硕士专业：预防兽医学指导教师：孙继国;甘永华2003.5.1河北农业大学倾卜论文摘要本实验采川柠檬酸三钠还原氯金酸，制各胶体金颗粒。根据不同粒径的胶体金颗粒在检测时所璺现的颜色鲜艳(容易分辨)程度，选择20nm的胶体金颗粒作为标记物。新城疫病毒用低温超速离心法进行提纯，然后免疫动物：对制备的血清采用辛酸一硫酸铵盐析法进行纯化：抗体经常规PAGE和琼脂扩散试验，结果显示辛酸一硫酸铵法纯化的抗体，纯度和活性均较高。胶体金标记最低稳定量和最适的pH的试验

2、结果为30ug／ml及pH为9．0：对标记后的抗体用低温超速离心法进行纯化。经过试验胶体金标记抗体最适稀释倍数为1：2，兔抗新城疫抗体平¨羊抗兔抗体的合适点样艇分别为500ug／ml和300ug／mI。制作的试纸条能够在5min左厶显示清晰的条带。同时加入的稳定剂，能够使抗体保持较长时间的活性和使金标抗体释放较为完全，在4"C干燥器中保存8个月后效果仍然很好。用本试纸条平¨ELISA对157个样品进行检测。结果显示：新城疫胶体金免疫层析法是一种快速、灵敏度高、特异性强的检测NDV的方法．可以用r流行病学调查，及SPF鸡场的净化。本试纸条

3、的研制为进一步研究和开发一系列畜禽疾病快速诊断金免疫层析试纸条奠定了实验基础。关键词：胶体金：免疫层析；新城疫病毒：快速诊断试纸条第1页英文简写APSBSAFBSEDl、AELISAGICAGIFAHAIgGNCNDVoDPAGEPBSPCRPEGSPFTBSTMBTEMEDTrjs主要缩略词表英文全称AmmoniumpersulfateBovineserumalbuminFetalbovineserumEthylenediaminetetraceticacidEnzyme-linkedimmunosorbentassayGoldimm

4、unochromatographicassayGoldimmunogoldfiltrationassayHaemagglutinationtestlmmunoglobulinGNitrocelluoseNewcastlediseasevirusOpticaldensityPolyacrylamidegelelectrophoresisPhosphatedbufferedsalinePolymerasechainreactionPolyetbyleneSpecificpathogenfreeTrisbufiersalineTetramet

5、hylbenzidineTetrametbylet埘lenediamineTris(hydroxymethyl)aminomethane中文全称过硫酸铵牛血消白蛋白胎牛血清乙二胺四乙酸酶联免疫吸附测定免疫层析试验免疫渗滤试验血凝试验免疫球蛋白G硝酸纤维素新城疫病毒光密度聚丙烯酰胺凝胶电泳磷酸盐缓冲液聚合酶链式反应聚乙二二醇无特定病原的"Iris缓冲盐液四甲基联苯胺四甲基乙二胺三羟甲基氨基甲烷第2贞河北农业大学硕士论文文献综述一、胶体金免疫层析技术80年代出现在临床诊断领域的金免疫层析(GICA)快速诊断试纸条是建立在金免疫渗滤基础之上的

6、一种免疫检测技术。它具有简单快速、结果明确、无需复杂操作技巧和特殊设备、灵敏度高等优点，并有浓缩的ELISA”’“之称，己成为临床诊断领域发展的一个新方向，在发达国家己得到广泛应用”1，我国这一领域的研究尚处于起步阶段。’1971年，Faulk和Taylor首先将兔抗沙门氏菌抗血清与胶体金颗粒结合，用直接免疫细胞化学技术检测沙门氏菌的表面抗原，成功地实现了在电镜水平对抗原的定位，建立了金免疫法。该法不仅适合透射电镜下对组织细胞内的抗原定位，亦可用于扫描电镜下对细胞表面抗原的定位，同时，利用不同大小的金颗粒，可在同一切片上实现对多种抗原的

7、双重或多重标记。此后，他们还把胶体金与抗胶原血清、植物血凝素、卵白蛋白、人免疫球蛋白轻链和牛血清白蛋白等结合应用。1981年Danscher建立了Hj银显影液增强光镜Ii金颗粒可见性的免疫金银染色法(IGSS)。到了1986年Fritz等人在免疫金银法基础上成功地进行了彩色免疫金银染色，使得结果更加鲜艳夺目。近10年米胶体金技术得到了迅速发展羽旷泛应J{』。使J_I』胶体金为标记物不仅在光镜和电镜下观察细胞和组织结构，还可以进行定位，定性以至定量研究。目前它已被应用于医学和生物学研究的众多领域。(一)、胶体金的性质及其制备【j4‘胶体金

8、(colloidalgold)也称金溶胶(golds01)，是由氯金酸被还原成原子金后形成的金颗粒悬液。胶体金颗粒由一个基础金核(原子金Au)及包围在外的双离子层构成，紧连在金核表面的是内层负离子(AuCl