制备及免疫胶体金诊断试纸条的研制

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1、山东农业大学硕士学位论文鸡新城疫单克隆抗体制备及免疫胶体金诊断试纸条的研制姓名：李希友申请学位级别：硕士专业：预防兽医学指导教师：崔言顺;田夫林20060606Y90390,q关于学位论文原创性和使用授权的声明本人所呈交的学位论文，是在导师指导下，独立进行科学研究所取得的成果。对在论文研究期间给予指导、帮助和做出重要贡献的个人或集体，均在文中明确说明。本声明的法律责任由本人承担。本人完全了解山东农业大学有关保留和使用学位论文的规定，同意学校保留和按要求向国家有关部门或机构送交论文纸质本和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权山东农

2、业大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。保密论文在解密后应遵守此规定。论文作者签名：奎叛铷签名：栏日期：逾6：6，2Q山东农业大学硕士学位论文摘要新城疫是山新城疫病毒引起的高度接触性、传染性疫病，发编急，感染率和死亡率高，曾给养禽业，特别是养鸡业造成了J_f一重的经济损失。本研究利用柠檬酸钠还原氯金酸，形成胶体金颗粒，应用一定真径的胶体金颗粒标记新城疫抗体或者抗原，从而建立起以免疫层析为基础的胶体金标I己的快速诊断方法。这一诊断方法可以用来诊断抗原，也

3、可以用永诊断抗体。本试验一方面制备单克隆抗体．制作了快速准确测定抗原的胶体金试纸条，并保汪试纸条的特异性；另一方面制作了半定量快速检测抗体的胶体会试纸条，并保证试纸条的敏感性。本试验首先将增嫡的NDV用差速离心和过Sephacryll”S-200葡聚糖分子筛层析的方法进行纯化，并测定其纯度，经鉴定纯化结果良好，为做多克隆抗体和单克隆抗体准备好了抗原。兔抗ND

4、m清抗体(【g(；)的提纯采用了辛酸～硫酸铵法，提纯的IgG的纯度鉴定采用聚丙烯酞股凝胶电泳法。免疫胶体金的制备是实验的重点。经过反复实验，制备了直径为2(}nm胶体金颗粒，

5、确定了胶体金与抗原和抗体的最佳结合量为36ug／ml，最佳pH值为9．0利8．2，同时确定了在制备试纸条时，在检测线和对照线上蛋白的最佳喷洒浓度为O．6mg／ml和0．5mg／m[。测定抗体的胶体金试纸条是用NDV标记，用兔抗NI)V抗体196作为对照线，用NDV为检测线，当检测抗体高于4个滴度的时候，检测线将出现浅红色，随着抗体水平的增高，红色逐渐加深，同时对照线也出现红色。逦过对检测血清稀释后，试纸条变为最低检测6个滴度，以便于在临床上评估新城疫的免疫效果。单克隆抗体的制备采用常用的方法。本研究确定了删接ELISA筛选阳性杂交

6、瘤细胞株的最佳反应条件，以建立的该方法对融合后杂交瘤细胞进行检测筛选，经过仞检、二检，共获得阳性杂交瘤细胞株l0株。利用有限稀释法进行3次亚克隆后，最终获得单抗2株，分别命名为4E8和5E6。鸡新城疸单克隆抗体制备及免疫版体金诊断试纸条的研击列这2株单抗的效价和特异性测定结果表明，其E1．ISA效价以qE8较高，可达1：l02，400，平均腹水中抗体效价要比自l

7、胞上清中高大约20()倍，2株单执特异性!好。测定NDV的胶体金的试纸条，是用胶体会标记单克隆抗体4E8，用兔抗鼠二抗作为剥照线，用另一株单抗5E6作为榆测线。用单抗结合

8、胶体金制作检测NOV抗原的试纸条，使试纸条的特异性更强，不但会在i

9、f7；床上能够更加准确、快速的渗断NDV，而目可以给实验室应用提供了一种更为简便的途径。两种方法最大优点是列‘试验仪器条件和人员技术要求不高，而且在5～lO分钟内即能出现结果，另外，其敏感性、特异性、重复性、稳定。肚均达到了要求。用检测抗体可及时评估新城疫的免疫效果，用检测抗原试纸条及时检测鸡群是否带毒，将两种试纸条联合应用，将对鸡新城疫的预防和控制有重要意义。关键词：新城疫试纸条胶体金单克隆抗体山东农业大学硕士学住论文Pi’eparationofmonoclon

10、alantibodyandiInmunochromatogl’aphyteststripforNewcastleDiseaseLiXiyouProf．CuiYanshunDepm‘tmentofPre—veterinarymedicine．CollegeofAnimalScienceandVetei+mai．YMedicine，ShandongAgl。iculttu‘eUMveJ。sity．Taian271018ABSTRACTNewCastlediseaseisallacuteandlfighlycontagiousdiseas

11、ecausedbyNewcastlediseasevirus，whichcauseshighrateofinfectionanddeathandgreateconomiclossestothepoultryindustry，especiallyto