贝类单孢子虫和折光马尔太虫二重荧光定量PCR方法的建立

贝类单孢子虫和折光马尔太虫二重荧光定量PCR方法的建立

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1、第31卷第3期渔业科学进展Vo1.31,NO.32O1O年6月PROGRESSINFISHERYSCIENCESJun.,2010贝类单孢子虫和折光马尔太虫二重荧光定量PCR方法的建立谢丽基谢芝勋庞耀珊刘加波邓显文谢志勤(广西兽医研究所,南宁530001)摘要根据GenBank中单孢子虫和折光马尔太虫基因序列,用PrimerExpress2.0软件设计了两对引物和两条TaqMan探针。对反应条件和试剂浓度进行优化,建立了能够同时检测单孢子虫和折光马尔太虫的二重荧光定量PCR方法。该方法对单孢子虫和折

2、光马尔太虫的检测敏感性达到4O个模板拷贝数;此外抗干扰能力强,对单孢子虫和折光马尔太虫不同模板浓度进行组合,仍可有效地同时检测到这两个原虫。该方法对派琴虫、荧光假单胞茵、副溶血弧菌、溶藻弧菌、河弧茵和拟态孤菌等病原体的检测,结果全为阴性。研究建立的单孢子虫和折光马尔太虫荧光定量PCR具有特异、敏感、快速、定量、重复性好等优点,可用于贝类单孢子虫和折光马尔太虫感染的检测。关键词单孢子虫折光马尔太虫二重荧光定量PCR中图分类号$944.3,Q78文献识别码A文章编号1000—7075(2010)03—0

3、077-07Developmentofduplexreal—timePCRassayfordetectionofHaplosporidiumsp.andMarteiliarefringensinshellfishXIELi-jiXIEZhi—xunPANGYao—shanLIUJia—boDENGXian—wenXIEZhi——qin(GuangxiVeterinaryResearchInstitute,Nanning530001)ABSTRACTTwosetsofspecificoligonuc1

4、eotideprimersforHaplosporidiumsp.andMar—teiliarefringens,alongwithtwoTaqManprobesspecificforeachprotozoanparasitewerede—signedwithPrimerExpress2.0software.Thereactionparameterssuchastheconcentrationoftwopairofprimers,twoTaqManprobesandthereactionbuffer

5、wereoptimizedtOdevelopdu—plexreal—timePCRassayfortherapiddetectionofHaplosporidiumsp.andMarteiliarefrin—gens.Thesensitivityofduplexreal—timePCRassaywas40templatecopiesforHaplosporidiumsp.andMarteiliarefringens.Theduplexreal—timePCRassaywasfoundtobespec

6、ificandtobeabletodetectanddifferentiateHaplosporidiurnsp.andMarteiliarefringens,andnoposi—tiveresultswereobservedwhennucleicacidfromPerkinsussp.,Pseudornonasfluorescens,Vib—rioparahaemolyticu,V.Alginolyticu,V.FluvialisandV.Mimicuswereusedasduplexreal—t

7、imePCRtemplates.Thisduplexreal—timePCRassayisarapid,sensitive,andsp~cifictestfor国家百千万人才工程人选专项资金项目(No.945200603)和广西科技攻关项目(桂科攻0630001—3M)共同资助*通讯作者。E—mail:xiezhixun@126.corn,Tel:(0771)3105702收稿日期:200907—09;接受日期:2009—09—09作者简介:谢丽基(1981一),女,硕士,主要从事动物传染病病原分子

8、生物学研究。E—mail:xieliji2009@yahoo.cn,Tel:(0771)312037178渔业科学进展第3l卷detectionofHaplosporidiumspandMarteiliarefringensandwillbeusefulforthecontroloftheseprotozoanparasitesinshellfish.KEYWORDSHaplosporidiumsp.MarteiliarefringensDuplexreal—time

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