贝类单孢子虫和折光马尔太虫二重荧光定量PCR方法的建立

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1、第31卷第3期渔业科学进展Vo1．31，NO．32O1O年6月PROGRESSINFISHERYSCIENCESJun．，2010贝类单孢子虫和折光马尔太虫二重荧光定量PCR方法的建立谢丽基谢芝勋庞耀珊刘加波邓显文谢志勤(广西兽医研究所，南宁530001)摘要根据GenBank中单孢子虫和折光马尔太虫基因序列，用PrimerExpress2．0软件设计了两对引物和两条TaqMan探针。对反应条件和试剂浓度进行优化，建立了能够同时检测单孢子虫和折光马尔太虫的二重荧光定量PCR方法。该方法对单孢子虫和折

2、光马尔太虫的检测敏感性达到4O个模板拷贝数；此外抗干扰能力强，对单孢子虫和折光马尔太虫不同模板浓度进行组合，仍可有效地同时检测到这两个原虫。该方法对派琴虫、荧光假单胞茵、副溶血弧菌、溶藻弧菌、河弧茵和拟态孤菌等病原体的检测，结果全为阴性。研究建立的单孢子虫和折光马尔太虫荧光定量PCR具有特异、敏感、快速、定量、重复性好等优点，可用于贝类单孢子虫和折光马尔太虫感染的检测。关键词单孢子虫折光马尔太虫二重荧光定量PCR中图分类号$944．3，Q78文献识别码A文章编号1000—7075(2010)03—0

3、077-07Developmentofduplexreal—timePCRassayfordetectionofHaplosporidiumsp．andMarteiliarefringensinshellfishXIELi-jiXIEZhi—xunPANGYao—shanLIUJia—boDENGXian—wenXIEZhi——qin(GuangxiVeterinaryResearchInstitute，Nanning530001)ABSTRACTTwosetsofspecificoligonuc1

4、eotideprimersforHaplosporidiumsp．andMar—teiliarefringens，alongwithtwoTaqManprobesspecificforeachprotozoanparasitewerede—signedwithPrimerExpress2．0software．Thereactionparameterssuchastheconcentrationoftwopairofprimers，twoTaqManprobesandthereactionbuffer

5、wereoptimizedtOdevelopdu—plexreal—timePCRassayfortherapiddetectionofHaplosporidiumsp．andMarteiliarefrin—gens．Thesensitivityofduplexreal—timePCRassaywas40templatecopiesforHaplosporidiumsp．andMarteiliarefringens．Theduplexreal—timePCRassaywasfoundtobespec

6、ificandtobeabletodetectanddifferentiateHaplosporidiurnsp．andMarteiliarefringens，andnoposi—tiveresultswereobservedwhennucleicacidfromPerkinsussp．，Pseudornonasfluorescens，Vib—rioparahaemolyticu，V．Alginolyticu，V．FluvialisandV．Mimicuswereusedasduplexreal—t

7、imePCRtemplates．Thisduplexreal—timePCRassayisarapid，sensitive，andsp~cifictestfor国家百千万人才工程人选专项资金项目(No．945200603)和广西科技攻关项目(桂科攻0630001—3M)共同资助*通讯作者。E—mail：xiezhixun@126．corn，Tel：(0771)3105702收稿日期：200907—09；接受日期：2009—09—09作者简介：谢丽基(1981一)，女，硕士，主要从事动物传染病病原分子

8、生物学研究。E—mail：xieliji2009@yahoo．cn，Tel：(0771)312037178渔业科学进展第3l卷detectionofHaplosporidiumspandMarteiliarefringensandwillbeusefulforthecontroloftheseprotozoanparasitesinshellfish．KEYWORDSHaplosporidiumsp．MarteiliarefringensDuplexreal—time