实时荧光定量PCR方法诊断马尔尼菲青霉病方法的建立-论文.pdf

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1、广西医科大学学报JOURNALOFGUANGXIMEDICALUNIVERSITY2014Jun；31(3)IIRSI实时荧光定量PCR方法诊断马尔尼菲青霉病方法的建立莫冬冬曹存巍△余进尬(广西医科大学第一附属医院皮肤科南宁530021)摘要目的：建立马尔尼菲青霉病血清实时荧光定量PCR诊断方法，对马尔尼菲青霉DNA行绝对定量。方法：针对马尔尼菲青霉内转录间隔区设计特异引物和Taqman探针，对马尔尼菲青霉、16种常见致病真菌、2种常见致病细菌和人基因组DNA行实时荧光定量PCR扩增，检测其特异性；以1O倍浓度梯度的重组质粒为标

2、准品，检测其敏感性。结果：该PCR方法特异度达100％；该方法最低检测限介于5～10copies之间。结论：实时荧光定量PCR方法有助于早期、特异地诊断马尔尼菲青霉病。关键词马尔尼菲青霉病；实时荧光定量PCR；诊断中豳分类号：R751文献标志码：A文章编号：1005-930X(2014)03—0515—02马尔尼菲青霉病(Penicilliosismarneffei，PSM)是由马尔多孢子菌。所有株结合形态学和基因序列分析方法鉴定。尼菲青霉(Penieilliummarneffei，PM)感染引起的致死性侵袭1．2DNA的提取：

3、将各菌株接种于土豆培养基上，置于性真菌病，在东南亚地区及我国南部有区域性流行，是导致35℃温箱培养4～7d后，取2～3环的接种环量真菌，悬浮当地艾滋病患者死亡的第三大机会性感染[1]。随着艾滋病于DNA提取液中，30000r／rain旋涡振荡30min后56℃水患者的增多，该病发病率呈逐年上升趋势。该病病情凶险，浴20min，14500r／rain离心10min，弃去上清，用酚氯仿法若不能早期诊断并获得及时的抗真菌治疗，死亡率可高达提取真菌基因组DNA。人全血的DNA参照QIAampBlood75[1]。然而PSM临床表现复杂，

4、缺乏特异临床表现和体DNAMinikit(德国，QIAGEN)步骤进行，提取的DNA溶解征，依靠临床资料容易误诊或漏诊。目前临床上诊断PsM于lOOp．LTE中。仍依赖于传统的真菌培养与形态学鉴定，该法平均需要耗时1．3标准品的制备：用PM的引物(表1)扩增PM基因组标7～14d，远远不能满足临床需要。随着现代诊断技术的迅猛准株DNA，扩增产物纯化后导入pEASYTM-T5克隆载体(北发展，非培养的诊断技术使得该病的诊断方法多元化，并在京，全式金)，重组载体转化入T0P10大肠杆菌中。提取质一定程度上提高了敏感性和特异性，如原位

5、杂交、巢式PCR、粒，双向测序证实含有目的片段，并通过浓度检测计算其抗原检测等[2]。但由于操作步骤繁琐、污染机会大、部分存copies。将PM标准品进行1O倍梯度稀释，使其浓度为在交叉反应等原因，使得上述方法难以兼顾高度的特异性和1×10～1eopies／~L，稀释后的标准品存放于4℃，存放时间敏感性。本研究采用的基于Taqman探针的实时荧光定量不超过24h。以梯度稀释的标准品为模板，进行实时荧光定PCR方法，建立反应体系，并初步应用于临床血清标本的检量PCR扩增。测，具有高度特异、敏感、快速、定量的的优势。1．4引物和探针

6、的设计：根据Genebank上公布的PM标准株FRR2161序列(序列号L37406)，PM特异性引物和探针1材料与方法结合于5．8SrRNA基因和ITS2区。引物及探针的特异性均经ABIPrimerExpress3．0软件和BLAST加以验证。引物1．1菌株和临床血清标本来源：PM标准株FRR2161由澳及探针(表1)由上海生物生物技术有限公司合成。大利亚墨尔本大学Alex教授惠赠；余菌株来源于北京大学1．5PCR扩增：实时荧光定量PCR20L反应体系中含引真菌与真菌病研究中心保存的标准株和部分临床分离株，其物各5／~moL、

7、TaqMan探针4／~moL、10肛L2×TaqManuni—包括烟曲霉、黄曲霉、黑曲霉、构巢曲霉、土曲霉、米曲霉，白versalPCRmastermix(美国，AppliedBiosystem)以及模板念珠菌、近平滑念球菌、光滑念珠菌、克柔念球菌、热带念珠1～5L反应条件按照ABI7500平台默认程序进行，反应菌、新生隐球菌、卷曲毛霉、不规则根毛霉、米根毛霉、尖端赛终点时读取达到阈值荧光量的循环数(Ct值)。每个梯度标准品、菌株和人基因组DNA样本均设至少3个复孔，同一梯*基金项目：国家自然科学基金资助项目(No．810601

8、28，81271804)；国度标准品、样本分4个批次检测。家自然科学基金一广东联合基金资助项目(No．U0932003)；广西自然1．6对照设置：每次反应均以标准品或PM标准株DNA为科学基金资助项目(No．0991144，2012GXNSFAA053109)；