侵袭性马尔尼菲青霉感染实时荧光定量 PCR检测技术的初步建立-论文.pdf

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1、JDiagnTherDermato—Venereol，Jun．2014．Vo1．21，No·实验方法·侵袭性马尔尼菲青霉感染实时荧光定量PCR检测技术的初步建立鲁莎，席丽艳，胡永轩(1．中山大学孙逸仙纪念医院皮肤性病科，广东广州510120；2．南方医科大学第三附属医院皮肤科，广东广州510630)[摘要]目的：建立一种快速、稳定、灵敏且可定量的检测马尔尼菲青霉病的SYBRGreenI实时荧光定量PCR方法。方法：根据马尔尼菲青霉ITS序列，设计并合成引物，通过常规PCR扩增目标序列后，将鉴定正确的目的基因片段克隆人

2、pGEM—T载体中，转化大肠杆菌JM109，经PCR及测序鉴定后得到阳性重组质粒，作为标准品模板建立SYBRGreenI荧光定量PCR标准曲线和溶解曲线，得出拷贝数与循环阈值之间的线性关系曲线表达式，并做灵敏性、特异性试验。结果：荧光定量PCR标准曲线阈值与模板浓度呈良好的线性关系，溶解曲线特异，相关系数为1．938，最低检测的拷贝数为8．5个／反应管。结论：建立了检测马尔尼菲青霉病的SYBRGreenI实时荧光定量PCR方法，为该病的早期诊断及定量分析感染程度及对治疗的指示作用奠定了良好的基础。[关键词]马尔尼菲青

3、霉病；SYBRGreenI；实时定量PCR[中图分类号]R379[文献标识码]ADOI：10．3969／j．issn．1674—8468．2014．03．031马尔尼菲青霉病(penicilliosismarneffei，本研究拟探讨SYBR．GreenI荧光定量PCR检测PSM)是由马尔尼菲青霉(penicilliummarnefei，技术用于马尔尼菲青霉病的检测，以期完善核酸P．marnefei)感染引起的地域性深部真菌病，主技术用于早期诊断PSM的方法。要在东南亚流行，我国以广东、广西多发。临床表1材料与方法现

4、多样，且易合并其他机会性感染，造成临床表现1．1材料的复杂性，加之该病的无特征性1-2]，PSM常被误1．1．1主要试剂和仪器SYBR荧光定量PCR诊，延误了治疗。但目前对该病的早期诊断方法反应液、100bpDNAmarker，小量质粒快速提取试匮乏，可正式用于临床的方法仍主要以各种无菌体液、活检组织等真菌学直接镜检及培养等传统剂盒，DNA凝胶回收试剂盒，均购自Takara；方法找到病原菌为诊断的金标准。此类方法虽然pGEM-T载体购白Promega公司；LightCycler480直接、准确，但耗时长(需2～4周)

5、且需要有充足实时定量PCR仪由美国Roche生产。的临床标本、有经验的专业技术人员和特殊实验1．1．2实验用菌株实验用马尔尼菲青霉为临室。因此，开发快捷、特异、高效诊断PSM的方法床分离株，分离自一名艾滋病患者，保存在我院医尤为重要，其中血清学及分子生物学诊断是真菌学真菌研究中心(菌株号SUMS0307)，经形态学学家关注的热点。但分子生物学方法在马尔尼非和DNA测序鉴定；对照菌株：白念珠菌、光滑念珠青霉病的诊断中尚处于实验室初步探索阶段，我菌、近平滑念珠菌、组织胞浆菌、申克孢子丝菌、裴们前期已对多种方法进行了体外实

6、验的探讨引。氏着色霉、Fonsecaea．monophora、新生隐球菌、卡氏枝孢霉、烟曲霉，均为临床分离株并已行分子生基金项目：“艾滋病和病毒性肝炎等重大传染病防治”科技重大专物学鉴定；工程菌JM109感受态细胞购自Pro—项(编号：2013ZX10004612)通信作者：席丽艳，E-mail：xiliyan@mail．sysu．edu．cnmega公司。丝堂蠢2014年6月第21卷第3期263GMSstainsforthediagnosisofonychomycosis[J]．Jcu．firmedpachyony

7、chiacongenita[J]．JAmAcadDermatol，tanPathol，2010，37(10)：1041—1044．2012，67(4)：680-686．[7]PaugamA，LollivierC，ViguieC，eta1．Comparisonof[14]宋翔，万慧颖，应川蓬．非真菌性甲病的诊断与病理real-timePCRwithconventionalmethodstodetectderma．[A]．中华医学会．中华医学会第十四次全国皮肤性tophytesinsamplesfrompatientsw

8、ithsuspecteddermato—病学术年会论文汇编[C]．北京：中华医学会，2008：1．phytosis[J]．JMicrobialMethods，2013，95(2)：[15]RuanJ，WangXM，XiaMN．Theevaluationofnailheath218_222．conditionswithskinultrasound