病毒性软化病病原（桐乡株）的分离鉴定及ELISA检测方法的初步应用

《病毒性软化病病原（桐乡株）的分离鉴定及ELISA检测方法的初步应用》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。

1、浙江大学硕士学位论文致谢本论文是在导师鲁兴萌教授的精心指导和悉心关怀下完成的。从选题、实验设计、实验操作到论文的撰写，鲁老师都给予了耐心的指导和帮助，老师严谨的治学态度、求实的工作作风、忘我的工作热情和诲人不倦的精神，使我终身受益。两年来，导师在我的学习、科研和生活中给予诸多的关怀、谆谆的教诲和悉心的指导，令我终生难忘。谨此论文完成之际向业师表示衷心的感谢与崇高的敬意!在学习和研究期间，得到了浙江大学生物所陈正贤老师诸多指导和大力支持，得到了博士生费晨、硕士生陆奇能、陈洪松、张海燕等人的大力帮助

2、。此外，还要特别感谢金伟教授，虽年逾古稀，仍不辞辛劳，在试验过程中给予了悉心指导和帮助。特别感谢博士生张凡在实验上给予的无私的帮助和鼎力支持，正因为得到了上述各位，以及那些曾热心相助而未曾提及的老师、同学、朋友们的大力帮助与指导，使本论文才得以顺利地完成，在此表示诚挚的感谢!同时向即将参加本论文评阅和答辩工作的各位专家致以深深的谢意!最后，我深深地向我的妻子安忠花及家人们表示谢意，感谢她们对我的理解、支持、鼓励和奉献，使我能以乐观的心态积极地去面对一切，顺利毕业。值此论文完成之际，谨以本文献给所

3、有关心、帮助和爱护我的领导、老师、同学和朋友们，恭祝他们身体健康、家庭幸福、工作顺利。朱宏杰2006年5月浙江大学硕士学位论文摘要家蚕病毒性软化病是家蚕四种病毒病之一，对蚕业生产造成非常严重损失的病害。日本学者Yamazaki等在1960年最早报道家蚕软化病毒，其后该病毒在日本得到广泛的研究。Ayuzawa(1972)首次应用超速离心法从家蚕获得该病的病原一家蚕病毒性软化病病毒(Bombyxmoriinfectiousflacherievirus，BmlFV)。Kawase等(1980)研究表明

4、该病毒(家蚕软化病坂城株病毒)为细小核糖核酸病毒(pieomavirus)科病毒。Isawa等(1998)测定了坂城株BmlFV的全基因组序列，对核苷酸序列的比较(2C、3C和3D等)表明该病毒类似于哺乳动物和植物的细小核糖核酸病毒，但对其基因组结构和系统进化的推测研究表明该病毒与昆虫和植物的细小核糖核酸病毒有进化关系，因此将其定为类似细小核糖核酸病毒。我国是世界上最大的养蚕国，即具有BmlFV最大的可寄生群体，但有关该病毒的分离研究、在我国蚕桑地区的流行状况，以及危害程度等至今未见报导。本文对

5、从中国浙江桐乡蚕区分离的一株疑似家蚕病毒性软化病病毒的非包含体病毒进行了研究。从浙江桐乡收集的具有典型家蚕软化病症的病蚕，解剖取中肠，加磷酸盐缓冲液(pH=7．2)破碎匀浆。用氯仿抽提去除杂蛋白，40％硫酸铵(25"C)饱和度溶液盐析，10700r／min离心30min(4℃)去除杂质，蔗糖密度梯度超速离心(40％、30％、20％、10％的梯度，55000×g，2h)，紫外分光光度计检测吸收峰特征，电子显微镜下观察，病毒为非包涵体无囊膜，大小约为26nnl的球形粒子。从分离纯化的病毒粒子提取病毒

6、核酸，核酸的地衣酚反应呈阳性，二苯胺反应为阴性。将病毒核酸分别用DNaseI和RNaseA降解，经甲醛变性凝胶电泳分析病毒核酸能为RNase降解，而不被DNase降解，实验表明病毒核酸为RNA。分离纯化的病毒，经12％的分离胶SDS电泳分析，可见该病毒有4个主要蛋白及3个次要蛋白条带与已发表的BmIFV相似，但未见VP4。利用杂交瘤技术获得了2株分泌抗家蚕软化病毒抗体的细胞株4E12、3G3，并对他们所分泌的单克隆抗体做了初步的鉴定。用辛酸一硫酸铵方法纯化的单克隆抗体4E12和3G3的腹水蛋白质

7、浓度分别为：2．252m∥IIll和2．438mg／mh抗体类型及亚类鉴定结果表明，4E12和3G3的抗体类型及亚类均为IgGl；2株单克隆抗体腹水的间接ELISAII渐江大学硬士学位论文效价均达10击以上。TAS．ELISA测定表明，2株单抗仅对BmlFV有特异性反应，而与家蚕浓核病毒(BmDNV)无特异性反应。用Westernblotting对2株细胞分泌的单抗鉴定，表明它们的靶蛋白都是BmlFV的结构蛋白VPl(35kD)。利用制各的单抗建立了抗原包被的间接ELISA检测BmlFV方法，对

8、浙江省桐乡蚕区的病蚕样本检测表明，该病在该区感染流行较为普遍。，本文首次从中国浙江省桐乡市蚕区分离和初步鉴定了一株家蚕病毒性软化病病毒(BmIFv-cHN001)，建立了基于免疫学的检测方法，并对该病毒引起的病害流行状态作了初步的调查，这些研究也将为深入研究该病毒的特征，以及养蚕生产中控制该病害的流行等提供基础。关键词：家蚕病毒性软化病病毒核酸单克隆抗体间接ELISA111第一部分文献综述浙江大学硕士学位论文1小RNA病毒概述Strauss等(1996)依据RNA依赖性RNA聚合酶(RNA．de