猪病毒性腹泻病原elisa及luminex检测方法研究

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1、学校代码：10264研究生学号：M120104119上海海洋大学硕士学位论文猪病毒性腹泻病原ELISA及题目：Luminex检测方法研究EstablishmentofBAS-ELISAand英文题目：Luminexmethodsforviralpathogensdetectionofpigdiarrheadisease专业：临床兽医学研究方向：动物病毒学姓名：张清真指导教师：刘惠莉研究员二O一五年四月二十六日上海海洋大学学位论文原创性声明本人郑重声明：我恪守学术道德，崇尚严谨学风。所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经明确注明和引用的内容外

2、，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品及成果的内容。论文为本人亲自撰写，我对所写的内容负责，并完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名：日期：年月日上海海洋大学学位论文版权使用授权书学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅或借阅。本人授权上海海洋大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。保密□，在年解密后适用本版权书。本学位论文属于不保密□学位论文作者签名：指导教师签名：日期：年月日日期：年月

3、日上海海洋大学博/硕士学位论文答辩委员会成员名单姓名工作单位职称备注李家乐上海海洋大学教授主席张德福上海市农业科学院研究员委员易建中上海市农业科学院研究员委员俞菊生上海市农业科学院研究员委员孙晓梅上海市农业科学院助理研究员秘书答辩地点上海市农业科学院答辩日期2015.6.5猪病毒性腹泻病原ELISA及Luminex检测方法研究摘要引起猪腹泻的病毒性病原主要有猪流行性腹泻病毒（Porcineepidemicdiarrheavirus，PEDV）、猪传染性胃肠炎病毒（TransmissibleGastroenteritisvirus,TGEV）和轮状病毒（Porcinerotaviru

4、s，PRV)），其中PEDV与TGEV同属于冠状病毒科，是最重要的两种病原，引起发病猪严重腹泻、呕吐和脱水，各年龄的猪均都可感染，死亡率可高达100%。我国大部分省市地区都有这两种病发生的报道，临床上常呈混合感染，或继发感染，给养猪业造成了重大损失。目前实验室诊断方法以病毒分离鉴定、PCR扩增技术为主。病毒分离周期长，且难度大；而PCR检测存在一定比例的假阳性。本研究利用生物素-亲和素具有高亲和性的特性，将PEDV和TGEVIgG抗体分别进行生物素标记，并以商品化PEDVS蛋白单克隆抗体和TGEVS蛋白单克隆抗体作为捕获抗体，分别建立了检测PEDV、TGEV的生物素-亲和素系统双抗

5、体夹心ELISA检测方法，并初步建立单一病原检测的Luminex体系，为后续猪腹泻病原的多重检测方法研究奠定基础。1.PEDV双抗体夹心ELISA检测方法的建立以体外表达的PEDVS蛋白作为抗原，商品化抗PEDVS蛋白单克隆抗体作为捕获抗体，生物素标记的抗PEDVIgG作为检测抗体，建立了PEDV生物素-亲和素系统双抗夹心ELISA方法。结果表明，该方法可以检测到PEDVS蛋白的最低检测限量为20ng/ul，且稳定性和特异性较好。利用该方法对采集的25份临床猪腹泻样品进行检测，结果检出3份PEDV阳性样品，与RT-PCR检测方法的符合率为100%。2.TGEV双抗体夹心ELISA检

6、测方法的建立I以商品化的TGEVS蛋白单克隆抗体作为捕获抗体，纯化的TGEV细胞毒作为抗原，生物素标记的抗TGEVIgG作为检测抗体，建立了检测TGEV的生物素-亲和素系统双抗夹心ELISA方法。结果表明，该方法可检测TGEV细胞毒的最低浓度为17.5ng/μl，敏感性较好。此外，利用该方法对采集的25份临床猪腹泻样品进行检测，结果检出1份TGEV阳性样品，与RT-PCR检测方法的符合率为100%。3.PEDV、TGEVLuminex方法初步建立应用xMAP液相芯片技术原理，以建立的双抗夹心反应条件为参照，用偶联微球的商品化单克隆抗体和生物素化IgG抗体，初步建立了捕获PEDV、T

7、GEV病原的LiquiChip液相蛋白芯片检测方法。本研究成功建立了PEDV和TGEV的生物素-亲和素系统双抗夹心ELISA检测方法，且可用于临床样品的筛检。同时对Luminex检测方法进行初步研究，为建立猪腹泻多病原检测系统奠定了基础。关键词：猪流行性腹泻病毒，猪传染性胃肠炎病毒，双抗体夹心ELISA，液相芯片检测方法IIEstablishementofBAS-ELISAandLuminexmethodsforvirualpathogensdetectionofpi