水稻矮缩病毒Pns10和Pns11基因的原核表达及抗血清制备

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1、福建农林大学硕士学位论文水稻矮缩病毒Pns10和Pns11基因的原核表达及抗血清制备姓名：林宇巍申请学位级别：硕士专业：植物病理学指导教师：吴祖建20060401独创性声明本人声明，所里交的学位(毕业)论文，是本人在指导教师的指导下独立完成的研究成果，并且是自己撰写的。尽我所知，除了文中作了标注和致谢中己作了答谢的地方外，论文中不包含其他人发表或撰写过的研究成果。与我一同对本研究做出贡献的同志，都在论文中作了明确的说明并表示了谢意，如被查有侵犯他人知识产权的行为，由本人承担应有的责任。学位(毕业)论文作者亲笔签名：席末獭日期：互伊铧朗f>困论文使用授权的说

2、明本人完全了解福建农林大学有关保留、使用学位(毕业)论文的规定，即学校有权送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅；学校可以公布论文的全部或部分内容，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。保密，在年后解密可适用本授权书。口不保密，本论文属于不保密。d学位(毕业)论文作者亲笔签名指导教师亲笔签名：象碰馥一日期：矽辟钥侈同日期：油6．6．圹福建农林人学硕=I?学位论文摘要水稻矮缩病毒(Ricedwa矿virus，RDV)是呼肠孤病毒科(Reoviridae)植物呼肠孤病毒属(Phytoreovirus)的成员，能引起水稻矮缩病。最早于1883年，在日本首先被

3、发现，现今主要流行于日本、朝鲜、东南亚以及我国东南部等水稻产区，对水稻生产造成一定影响。RDV基因组包括12条双链RNA片段(sl-s12)，本文通过对云南RDV分离物基因组S／O和剐，片段编码区克隆，原核表达并制备了PnslO和Pnsll融合蛋白的抗血清，为进一步研究基因的功能奠定了基础。利用Trizol法从感病水稻叶片中获取该病毒的全基因组，根据RDV福建分离株(RDV-F)S／O开放阅读框(OFF)核苷酸序歹O(ntl4—1075)和Sll丌放阅读框核苷酸序列(nt30．575)分别设计含有合适酶切位点的引物，通过RT-PCR方法扩增出特异性目的条带

4、。PCR扩增产物经回收、连接、转化DH5a大肠杆菌克隆至pMDl8-T载体上，经蓝白斑和氨苄青霉素抗性筛选、PCR和双酶切法鉴定，分别获得了重组质粒pT-S10和pT-S1l，并进行序列测定。应用生物信息学软件对编码蛋白的理化性质、跨膜区、功能域及蛋白的二级结构进行预测分析。重组质粒经双酶切后分别将目的基因转入pGEX-4T-1载体，获得原核表达载体pGEX．S10和pGEX，S11。将原核表达载体转入BL21star(DE3)E．coli中得到了高效表达，分别获得了约59kD的Pnsl0融合蛋白和46kD的Pnsll融合蛋白。将获得的两个融合蛋白分别免疫

5、大耳白兔制备了特异性抗血清，间接ELISA法测定抗血清效价为1：2048和1：3072，Westernblot鉴定表明抗血清特异性强。表达产物及多克隆抗体的获得为下阶段深入研究提供了实验材料。关键词：RDV；S／0；叫』；生物信息学；原核表达：抗血清福建农林大学硕：仁学位论文ExpressionandAntiserumPreparationofRDVPnslOandPnsllgeneAbstractRicedwarfvirus(RDV)，atypememberofPhytoreovirus,hascausedricedwarfdisease．Thedise

6、asewasfoundinJapanfirstlyin1883，whichOccursinJapan，Korea，easternandsouthernAsiaandChinanOWandcausesgreatdecreasestoriceyield．ThegcnomeofRDVcomprises12segmentsofdouble-strandedRNA(dsRNA)andinthispaperwestudycloningandexpressionofgenomeSegment10@10)andSegmentll(SJo)madantiserumprepa

7、rationofPnsloandPnsllfusionprotein．ThetotalRNAwasextractedfromRDVinfectedricetissuewimTriz01．TwosetsofPCRprimersweredesignedaccordingtotheORF(ntl4—1075)inthegenomesegment10andtheORF(nt30·575)inthegenomesegment1ofRDV-F(Fujianisolate)，respectively．cDNAofSlOORFandS／1ORFwereamplifiedu

8、singM—MuLVReverseTranscriptaseand