基于类人胶原蛋白的新型软骨组织工程水凝胶支架的制备及其性能研究

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1、分类号：Ｒ３１８．０８学校代码：１０６９７密级：公开学号：２０１５２０７２８馨ＮｏｒｔｈｗｅｓｔＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ硕士字位论文Ｍ’ＡＳＴＥＲＳＤＩＳＳＥＲＴＡＴＩＯＮ基于类人胶原蛋白的新型软骨组织工程水凝胶支架的制备及其性能研究学科名称：生物化工：作者：宋茜指导老师米钰教授西北大学学位评定委员会二〇一八年PreparationandPropertiesofNovelHydrogelScaffoldBasedonHuman-LikeCollagenf

2、orCartilageTissueEngineeringAthesissubmittedtoNorthwestUniversityinpartialfulfillmentoftherequirementsforthedegreeofMasterinBiochemicalEngineeringBySongXiSupervisor:MiYuProfessorJune2018摘要随着现代社会人口老龄化程度的加剧和人们对运动需求的增长，关节软骨损伤已成为一种困扰人们的常见问题。由于缺乏血液供应、不受神经支配和细胞密度低

3、，关节软骨的自我修复能力极差。现有的治疗技术虽有一定的疗效，但仍存在着治疗效果不持久、易导致免疫排斥反应等问题。目前，组织工程支架由于具有良好的生物相容性和机械完整性，已成为修复软骨损伤的热点。本课题以类人胶原蛋白（HLC）作为原料，谷氨酰胺转氨酶（TGase）作为交联剂，牛血清白蛋白（BSA）和氯化钠（NaCl）作为致孔剂，通过生物交联和热致相分离/冷冻干燥致孔技术制备得到了一种具有三维多孔结构的水凝胶支架，并尝试将其用于软骨缺损的修复和再生。本文首先通过正交优化实验对HLC水凝胶软骨支架进行优化实验，测定所

4、得各支架的机械强度、孔隙率、孔径来确定其最佳制备条件。随后，以不添加BSA的HLC水凝胶支架（HLCC）作为对照组，以最佳条件制备的HLC水凝胶支架（HLCS）作为实验组，分别测定了两种HLC水凝胶支架的内部结构、密度、孔隙率、溶胀率、力学性能、热稳定性、内毒素及外源DNA含量等，并对它们的理化性质进行了比较和分析。最后，本文对两种HLC水凝胶支架的生物学性能进行了探究。采用CCK-8法检测了支架浸提液的细胞毒性，通过AO/EB荧光染色和SEM观察了细胞在支架上的粘附及增殖情况，向小鼠注射支架的生理盐水浸提液以

5、测定其急性全身毒性程度，通过皮下降解试验观察支架的生物相容性和生物降解性，以及将支架植入兔子膝关节并对新生软骨组织进行H&E染色和番红O-固绿染色以检测支架的修复能力。实验研究结果表明：（1）HLCS水凝胶支架的最佳制备工艺条件为：类人胶原蛋白的浓度为120mg/mL，牛血清白蛋白的浓度为80mg/mL，NaCl的浓度为35mg/mL，谷氨酰胺转氨酶的浓度为6U/mL，混合溶液静置交联前的搅拌时间为3min，交联的最佳pH值为6，交联的最佳时间为10h，水凝胶支架的干燥方式为冷冻真空干燥。（2）HLCS水凝胶支

6、架的SEM以及密度和孔隙率结果显示，该支架经BSA和NaCl致孔后具有高贯通性的三维多孔结构，孔径在100〜300μm之间且孔隙率高达93.43%，可为软骨细胞的增殖和粘附提供足够的空间，并有利于营养物质和代谢废物的运输。（3）HLCS水凝胶支架溶胀率可达到216%，该支架具有快速吸水的类海绵性质，I能够快速吸收关节液，为软骨组织的再生保持一个适宜的环境。（4）HLCS水凝胶支加可压缩至80%，重复10个压缩循环后仍未发生显著形变，压缩模量约为0.96MPa，在具有高孔隙率的同时又保证了优良的力学性能。（5）内

7、毒素、外源DNA及急性全身毒性实验均表明HLCS水凝胶支架的毒性等级符合行业标准，是一种安全的软骨支架材料。（6）体外细胞毒性和细胞粘附性试验结果证明HLCS水凝胶支架均具有良好的细胞相容性，软骨细胞可以粘附在水凝胶支架上生长、增殖和迁移且支架浸提液对软骨细胞的生长和增殖还具有促进作用。（7）HLCS水凝胶支架植入到兔子皮下2周后会产生轻微的炎症反应，4周后炎症反应基本消失，6周后炎症反应完全消失，有微血管生成，水凝胶支架初步降解，8周后水凝胶支架完全降解，展现出了良好的生物相容性和生物降解性。（8）HLCS水

8、凝胶支架植入缺损部位12周后，软骨缺损完全被均匀的软骨样组织填充，仅能观察到一圈模糊的边界，新生软骨组织的H&E染色和番红O-固绿染色结果证明新生软骨组织中有充足的GAG沉积，HLCS水凝胶支架可有效修复关节软骨缺损。关键词：类人胶原蛋白，多孔水凝胶支架，软骨组织工程，生物相容性IIABSTRACTWiththeincreasingagingofthepopulationandpeop