酶交联水凝胶皮肤支架的制备及其性能研究

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1、分类号:R318.08学校代码：10697密级:公开学号：201520729酶交联水凝胶皮肤支架的制备及其性能研究学科名称：生物化工作者：雷桓指导老师：朱晨辉教授西北大学学位评定委员会二〇一八年PreparationandCharacterizationofEnzymaticCrosslinkedHydrogelSkinScaffoldsAthesissubmittedtoNorthwestUniversityinpartialfulfillmentoftherequirementsforthedegreeofMasterinBiochemicalEnginee

2、ringByLeiHuanSupervisor:ZhuChenhuiProfessor2018摘要摘要水凝胶是一种亲水、柔软、具有三维立体网络结构的物质，被广泛应用于工业，医药业等各个领域，在组织工程领域发展较好，随着皮肤缺损问题的日益严重，组织工程皮肤支架的需求增加。胶原-糖胺聚糖复合水凝胶的组合更加接近哺乳动物皮肤细胞外基质的构成，胶原和糖胺聚糖具有良好的生物相容性，降解时间也随着交联剂的交联作用变得可控，受到水凝胶材料研究工作者的重视。本文中，我们制备了一种胶原-糖胺聚糖的水凝胶，以谷氨酰胺转氨酶（TG）作为交联剂对其进行交联，制备出可以用于组织工程皮肤支

3、架的水凝胶材料。通过将类人胶原蛋白（HLC）复合不同的糖胺聚糖，制备出四种水凝胶，类人胶原蛋白水凝胶（GEL1），HLC复合透明质酸（HA）水凝胶（GEL2），HLC复合羧化壳聚糖（CCS）水凝胶（GEL3），HLC复合HA和CCS水凝胶（GEL4）。对这四种水凝胶进行相关的理化性能检测以及生物学方面的分析和研究。水凝胶制备工艺条件的优化：通过响应面优化水凝胶添加物中的HLC，HA及CCS的最佳添加量，通过单因素实验探究水凝胶添加物质中的盐和酶的最佳用量，并分析这些添加物对水凝胶拉伸性能和孔径的影响，得到各项性能都较为理想的水凝胶材料。通过对真空冷冻干燥过程中的

4、预冻过程的设计及研究，探究不同降温速率下冰晶形成过程对于水凝胶孔隙结构的影响，从而制备出良好孔径的水凝胶材料以适用于组织工程支架领域。水凝胶的理化性能探究：机械性能的检测是用万能试验压缩机测量水凝胶材料的压缩性能，循环压缩实验可以得到水凝胶的弹性模量，探究其抗变形性能。对水凝胶中糖胺聚糖的含量，凝胶分数，溶胀率，保水性能，热稳定性，孔隙特性，和外源DNA含量进行测定。探究水凝胶的细胞相容性：包括检测水凝胶的细胞毒性，通过细胞黏附实验以及活死细胞染色实验探究细胞在水凝胶上生长的状况。探究水凝胶的组织相容性：构建全层皮肤缺损模型，以验证水凝胶作为组织工程皮肤支架的修

5、复特性，通过将水凝胶植入新西兰兔皮下来探讨该种水凝胶材料作为组织填充材料的降解性能和组织相容性。实验研究结果表明：水凝胶最佳的制备工艺条件为：HLC的含量为10%（w/v），HA的含量为0.1%I西北大学硕士学位论文（w/v），CCS的含量为2%（w/v），交联剂TG的用量为60U/gHLC，NaCl浓度为2.5%（w/v），反应温度为4℃，反应时间为12h。程序冷冻干燥中的预冻降温速率设定为每分钟降温1℃。凝胶分数检测结果表明有少量的成分未被交联，而SDS凝胶电泳和HA及CCS的含量检测结果表明，大部分未被交联的物质，一部分是TG，另一部分是未交联的HA和CC

6、S，HA和CCS只有微量未被交联，表明这种糖类小分子可以稳定存在于水凝胶中。水凝胶的孔隙率，溶胀性能和保水性能结果显示，添加了HA和CCS的水凝胶的孔隙率，溶胀性能及保水性能都有所提高，一方面是因为HA和CCS是亲水物质，提供了如羟基和羧基等大量的亲水基团；另一方面添加了HA和CCS的水凝胶的孔隙较大，也能一定程度上提高其溶胀性能及保水性能。循环压缩实验表明HA的加入提高了抗压应力能力，CCS的加入提高了抗变形能力。热稳定性实验表明交联改善了凝胶的热稳定性，交联水凝胶与非交联材料之间的热稳定性存在显著差异。细胞毒性实验的结果显示：这四种水凝胶不仅没有毒性且都可以

7、促进细胞生长和增殖。细胞黏附和活死细胞染色实验结果表明细胞可以很好的在材料上黏附生长，而添加了CCS的水凝胶GEL3和GEL4的细胞黏附率要高于纯HLC制备的水凝胶GEL1，是因为CCS中的胺基基团能促进细胞黏附。新西兰兔背部全层皮肤缺损模型的修复实验结果显示：水凝胶能够促进伤口更快愈合且愈合后疤痕不明显。在愈合过程中，水凝胶逐渐降解，降解周期与伤口愈合周期平行，表明水凝胶是治疗皮肤创伤和皮肤溃疡的优良的医用材料。水凝胶植入动物体内后，炎症反应较小且在8周之内基本降解。说明了这四种水凝胶能很好的适应机体内环境，并在短期内能够降解，可以作为理想填充材料使用。本文利

8、用TG作为交联剂，HLC