基质γ-羧基谷氨酸蛋白MGP表达及活性改变对肾结石形成的影响

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1、分类号：单位代码：１０１４０密级：公开学号：４０３１５３１８６６◎ＬＩＡＯＮＩＮＧＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ硕士学位论文ＴＨＥＳＩＳＦＯＲＭＡＳＴＥＲＤＥＧＲＥＥ基质羧基谷氨酸蛋白ＭＧＰ表达及活性改变中文题目：对肾结石形成的影响１ＴｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆｔｈｅｃｈａｎｅｓｏｆｅｘｅｒｓｓｉｏｎａｎｄａｃｔｉｖｉｔｏｆＭａｔｒｉｘｇｐｙａｔｒｉｌｕｔａｍｉｃｒｏｔｅｉｎＭＧＰｏｎｔｈｅｆｏｒｍａｔｉｏｎｏｆｋｉｎｄｅｓｔｏｎｅｘｇｐ（）ｙ论文作者：张月指导教师：芦秀丽教授专业：生物化学与分子生物学完成时

2、间二〇一八年五月：申请辽宁大学硕士学位论文基质γ-羧基谷氨酸蛋白MGP表达及活性改变对肾结石形成的影响TheeffectofthechangesofexperssionandactivityofMatrixglutamicprotein(MGP)ontheformationofkindeystone作者：张月指导教师：芦秀丽教授专业：生物化学与分子生物答辩日期：2018年5月24日二○一八年五月·中国辽宁摘要摘要肾结石是一种由环境饮食因素和遗传因素引起的复杂疾病，以肾小管或肾间质的晶体异常沉积为特征，临床常表现为肾脏功能受损和尿路阻塞，发病率超过6-12%，五年再发率达50%，并

3、可终生多次再发。肾结石的形成机制复杂，至今对其分子形成机制仍不清楚，导致目前临床缺乏有效的治疗和预防措施，而多以碎石、手术等方式暂时缓解病症，不能在肾脏钙化的发病机制上对结石形成进行有效的药物抑制和再发预防。肾脏在维持和调节人体水、盐均衡，排除代谢废物的同时，易在肾小管形成盐的过饱和状态，在常见的代谢异常如高草酸尿、高钙尿的风险环境下，结晶沉积在肾小管或肾间质，导致肾脏钙化，结晶不断成核、聚集和生长，最终形成肾结石。在这个过程中，肾脏通过主动或被动的生物学行为表达和分泌一些大分子蛋白参与和影响结石形成。基质谷氨酸蛋白（MatrixGlaprotein,MGP）是一种维生素K依赖性的分

4、泌蛋白，研究表明MGP与血管钙化有关，是血管钙化的抑制剂。我们研究组先前研究发现，高草酸大鼠肾脏中在MGP蛋白表达的部位没有结晶出现，提示MGP可能也与肾结石的发病或病理过程相关，但具体分子机制不明。本研究拟分别在细胞和动物水平，通过调控MGP基因的表达量或者改变MGP蛋白的活性来阐明MGP蛋白对草酸钙结石形成及其对细胞损伤的影响，以探索MGP在肾结石形成中的具体作用机制。首先，我们研究了MGP基因表达改变在草酸钙结晶诱导肾小管上皮细胞损伤中的影响，我们构建了表达靶向MGP基因的小干扰RNA序列的重组腺病毒（Ad-siMGP），以及过表达MGP基因的重组腺病毒（Ad-MGP）。我们用

5、这两种腺病毒分别感染肾小管上皮HK-2细胞，同时分别设定对照组，以研究改变细胞内MGP基因的表达对草酸钙结晶形成的影响。实时荧光定量PCR实验的结果表明，Ad-MGP和Ad-siMGP分别转染HK-2细胞48h后，显著升高或者降低了MGPmRNA的水平。我们初步实验的原子吸收光谱检测结果表明，Ad-MGP所诱导的MGP基因高表达显著降低了草酸钙结晶与HK-2细胞之间的黏着力。暗示MGP基因的上调可以通过减弱细胞黏着力从而减轻结晶对细I摘要胞的黏着而发挥肾小管上皮细胞的保护作用。其次，我们利用草酸钙结晶刺激HK-2，研究了MGP蛋白的活性变化对结晶形成及对HK-2细胞损伤和凋亡的影响。

6、有研究证实，维生素K1能显著提升MGP蛋白活性，华法令则可以通过抑制维生素K1的合成发挥抑制MGP活性的作用，因此本研究中分别利用维生素K1和华法令上调或者下调MGP蛋白的活性，以草酸钙结晶联合维生素K1及华法令刺激HK-2，分别用MTT法及DAPI染色法检测MGP蛋白活性变化对细胞损伤及凋亡的影响。结果表明，在草酸钙结晶诱导了HK-2细胞损伤及凋亡的情况下，华法令的使用加重了结晶对细胞损伤及凋亡作用，而维生素K1与华法令的联合添加则缓和了华法令的作用。这一结果暗示，MGP在草酸钙结晶诱导的细胞损伤及凋亡中发挥细胞保护作用。我们进一步利用原子吸收光谱法检测草酸钙结晶对细胞黏着的影响，

7、结果表明维生素K1添加的细胞显示出显著的细胞黏着力的下降，暗示MGP蛋白的活化可以通过减弱细胞黏着力从而减轻结晶对细胞的黏着而发挥肾小管上皮细胞的保护作用。而Ad-siMGP诱导的MGP基因的下调逆转了维生素K1对结晶所致HK-2细胞引起的细胞粘着力的下降。这一结果证明维生素K1对肾小管上皮细胞抵抗草酸钙结晶的保护作用是通过增强MGP的活性实现的。最后，我们研究了动物水平上MGP参与肾结晶形成过程的可能影响。实验所用的大鼠随机分为三组，分别为空白对照组（-