IL-15对调节性T细胞自噬作用影响的研究

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1、单位代码10602学号2015011133分类号R34密级公开硕士学位论文IL-15对调节性T细胞自噬作用影响的研究TheeffectandmechanismofIL-15onautophagyinregulatoryTcells学院：生命科学学院学科名称：生物学研究方向：生物化学与分子生物学年级：2015级研究生：李佳童亚林教授指导教师：姚咏明教授完成日期：2018年6月IL-15对调节性T细胞自噬作用影响的研究专业名称：生物学申请人：李佳指导教师：童亚林教授姚咏明教授IL-15对调节性T细胞自噬作用影响的研究研究生:李佳年级:2015级导师：童亚林教授姚咏明教授学科专业：生物学研究方向

2、：生物化学与分子生物学中文摘要研究目的本实验利用BALB/c小鼠的调节性T细胞（Treg），研究在不同剂量、不同时间IL-15作用下，细胞发生自噬的情况以及免疫功能的变化。明确IL-15对Treg自噬作用和免疫功能影响。进一步利用IL-15、自噬抑制剂SBI-0206965或自噬诱导剂雷帕霉素（Rapamycin,Rap）处理细胞，探索IL-15通过调节Treg细胞自噬影响其功能的相关分子机制。研究方法1、取BALB/c小鼠脾脏，通过MiniMACs免疫磁性分离系统从单个核细胞中分离CD4+CD25+Treg细胞和CD4+CD25-T细胞（效应性T细胞，Teff）。利用流式细胞技术对细胞进

3、行纯度鉴定和活力检测。2、IL-15对Treg细胞相关分子Foxp3和CTLA-4表达的影响：将分离出的Treg细胞计数，以2×105个/孔接种于96孔板。按照IL-15浓度分为10ng/ml组、25ng/ml组、50ng/ml组和100ng/ml组；按照培养时间分组，分为12h组、24h组、48h组和72h组。分别给予相应剂量和IL-15处理相应时间，置于37℃、5%CO2培养箱静置培养。分别收集细胞后，采用流式细胞术检测Foxp3和CTLA-4表达水平。3、IL-15对Treg细胞自噬的相关分子LC3的影响：选取IL-15对Treg细胞活化影响的最佳剂量和时间条件。将分离出的Treg细

4、胞计数，以2×105个/孔接种于96孔板。对细胞进行分组：Control组、IL-15组、SBI组、IL-15+SBI组、Rap组、IL-15+Rap组。此外，为模拟脓毒症体外环境加入LPS，进行同样的分组。分别给予相应的试剂处理后，对细胞进行免疫荧光染色，共聚焦观察LC3的表达，研究Treg细胞内自噬体的形成情况。并收集细胞，利用流式细胞术检测LC3分子表达水平。4、IL-15和细胞自噬对Treg细胞相关分子Foxp3和CTLA-4表达的影响：将分离I出的Treg细胞计数，以2×105个/孔接种于96孔板。对细胞进行分组：Control组、IL-15组、SBI组、IL-15+SBI组、R

5、ap组、IL-15+Rap组。此外，为模拟脓毒症体外环境加入LPS，进行同样的分组。收集细胞后，Foxp3和CTLA-4分子进行流式细胞术检测其表达水平。5、IL-15对Treg细胞免疫功能的影响：采用ELISA法检测各个分组上清液中IL-10和TGF-β水平的变化。并将Treg和Teff进行共培养后，检测上清液中IL-2、IFN-γ和IL-4的分泌水平。研究结果1、按上述步骤从BALB/c小鼠单个核细胞中分选出CD4+CD25+Treg细胞后检测其纯度达到92%以上，Teff细胞的纯度为95%，苔盼蓝检测到CD4+CD25+Treg的活性均在94%以上。2、IL-15在剂量为100ng/

6、ml处理48h的条件下，Treg细胞表面分子Foxp3和CTLA-4的表达水平显著增加（P<0.01），在此情况下，IL-15对Treg细胞刺激最为明显。因此选定该条件处理后续实验。3、共聚焦显微镜观察免疫荧光和流式细胞术分析结果均显示，相较于Control组，IL-15组和SBI组LC3分子表达水平显著减少，IL-15+SBI组明显增加（P<0.05），Rap组和IL-15+Rap组显著上调（P<0.01）。在LPS刺激Treg细胞条件下，较Control组，IL-15组和SBI组的LC3分子表达水平显著下调，IL-15+SBI组明显增加（P<0.05），Rap组和IL-15+Rap组显

7、著增强（P<0.01）。4、流式细胞分析结果显示：相较于Control组，IL-15组和IL-15+Rap组细胞Foxp3表达显著上调（P<0.01），IL-15+SBI组和Rap组细胞Foxp3和CTLA-4表达均有增加（P<0.05）。在LPS刺激Treg细胞条件下，IL-15+Rap组细胞Foxp3和CTLA-4表达水平在比Control组显著增多（P<0.01）。5、采用ELISA技术检测各个组细胞培养上清液中细