泛素激活酶ubal对细胞自噬的调节机理研究

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1、华中农业大学硕士学位论文泛素激活酶Ubal对细胞自噬的调节机理研究姓名：张绍进申请学位级别：硕士专业：动物营养与饲料科学指导教师：晏向华；俞立201206泛素激活酶Ubal对细胞自噬的调节机理研究摘要细胞自噬是真核细胞中高度保守的一种溶酶体依赖性的降解途径，该途径通过形成双层膜状结构的自噬小体包裹待降解物质并最终与溶酶体融合释放内容物，在溶酶体酶的作用下将内容物降解并通过溶酶体膜上的通透酶将降解产物运回至细胞质中重新利用。由于细胞自噬在细胞生长、存活、发育和死亡过程中均有重要作用，因而细胞自噬在所有真核生物中均受到严密调控，现有研究发现细胞自噬的紊乱或失调与人类许多疾病相关，如癌症、肌病、

2、神经退行性疾病、心脏和肝脏疾病和胃肠道病症等。因而，充分研究细胞自噬的发生及调控机制对于这些疾病的临床治疗具有重要的指导意义。尽管目前对于细胞自噬发生的基本过程及分子机制己很清楚，但对于细胞白噬的具体调控机制仍存在很多未解决的问题。在本研究中，我们充分利用酵母菌的遗传学优势开展全基因组扫描筛选新的细胞自噬调控因子，鉴定出泛素激活酶Ubal为酿酒酵母中新的细胞自噬调控蛋白，并对其调节机理进行了初步解析。激光扫描共聚焦显微镜观察和Westernblot检测的结果均表明，Ubal的失活严重影响了营养充足条件下基础水平的细胞自噬以及氮源饥饿和葡萄糖饥饿诱导的细胞自噬，而导入含有野生型UBAl基因的

3、pRS313一UBAl质粒可使Ubal温度敏感型突变菌株ubal—ol中氮源饥饿诱导的细胞自噬恢复正常。Ubal的失活并不影响雷帕霉素靶蛋白复合体1(Thetargetofrapamycincomplex1，TORCl)活性的直接抑制剂雷帕霉素处理诱导的细胞自噬，表明Ubal对细胞自噬的影响很可能主要发生在TORCl上游。为了进一步确认Ubal对TORCl活性的影响，我们检测了酵母中TORCl的直接作用底物Sch9的磷酸化状态以反映其活性，结果发现Ubal的失活可以显著延迟氮源饥饿诱导的TORCl的失活，但不影响葡萄糖饥饿和雷帕霉素处理诱导的TORCl的失活，而且Ubal的失活并不影响TO

4、RCl失活后的重新激活。以上结果表明，Ubal主要是通过作用于TORCl上游的某个负调控因子或直接影响TORCl的活性进而调节氮源饥饿诱导的细胞自噬。值得注意的是，在葡萄糖饥饿条件下，ubal．ol菌株中的TORCl活性已跟野生型菌株一样迅速失活，但其细胞自噬却是严重受损的，表明Ubal对葡萄糖饥饿诱导的细胞自噬的影响可能还位于TORCl下游。因而我们检测了Atgl被招募到自噬小体前体结构(Pre．autophagosomalstructure，PAS)上这一过程是否受Ubal的影响，结果发现Ubal的失活并不影响营养充足以及雷帕霉素处理条件下的Atgl被招募到PAS上，但显著影响氮源饥饿

5、和葡萄糖饥饿条件下At91的正常招募。结合前面Ubal对TORCl活性影响的检测结果，我们推测Ubal对葡萄糖饥饿诱导的细胞自噬的影华中农业大学2012届硕士研究生学位论文响位于TORCl失活与A蟾1被招募到PAS上之间的某个步骤。于是我们紧接着检测了A培13的磷酸化状态及其与Atgl的相互作用，结果发现ubal．ol菌株在营养充足、氮源饥饿及葡萄糖饥饿条件下At913均处于高度磷酸化状态，基本上都检测不到Atgl3与Atgl的结合。由于ubal—ol菌株在葡萄糖饥饿条件下TORCl已正常失活，但其Atgl3仍处于高度磷酸化状态而无法与Atgl结合，表明Ubal很可能是通过调节在细胞自噬过

6、程中负责A蟾13去磷酸化的磷酸酶活性来影响葡萄糖饥饿诱导的细胞自噬。通过本研究，我们成功筛选鉴定出新的细胞自噬调控因子Ubal，并分别确定了其对氮源饥饿和葡萄糖饥饿诱导的细胞自噬的主要调节步骤。然而，对于Ubal调控细胞自噬的直接作用底物还有待进一步研究鉴定。关键词：细胞自噬；泛素激活酶Ubal；雷帕霉素靶蛋白复合体1；Atgl；Atgl32泛素激活酶Ubal对细胞自噬的调节机理研究AbstractAutophagyisanevolutionarilyconservedprocessbywhichportionsofcytosolandorganellesaresequesteredint

7、odouble—membranevesiclesanddegradeduponfusionwithlysosomalcompartments．Asautophagyisinvolvedincellgrowth，survival，developmentanddeath，thelevelsofautophagymustbeproperlyregulated．asindicatedbythefactthatdysregulat