烯键还原酶的固定化与应用研究

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1、分类号：Q814.2单位代码：10183研究生学号：2015344010密级：公开吉林大学硕士学位论文(专业学位)烯键还原酶的固定化与应用研究Studyontheimmobilizationandapplicationofenoatereductases作者姓名：李函类别：工程硕士领域.（方向）：酶工程指导教师：郑良玉教授培养单位：吉林大学生命科学学院2018年5月烯键还原酶的固定化与应用研究Studyontheimmobilizationandapplicationofenoatereductases作者姓名：李函领域（方向）：酶工程

2、指导教师：郑良玉教授类别：工程硕士答辩日期：2018年5月29日未经本论文作者的书面授权，依法收存和保管本论文书面版本、电子版本的任何单位和个人，均不得对本论文的全部或部分内容进行任何形式的复制、修改、发行、出租、改编等有碍作者著作权的商业性使用（但纯学术性使用不在此限）。否则，应承担侵权的法律责任。吉林大学硕士学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交学位论文，是本人在指导教师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，

3、均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名：日期：年月日《中国优秀博硕士学位论文全文数据库》投稿声明研究生院：本人同意《中国优秀博硕士学位论文全文数据库》出版章程的内容，愿意将本人的学位论文委托研究生院向中国学术期刊（光盘版）电子杂志社的《中国优秀博硕士学位论文全文数据库》投稿，希望《中国优秀博硕士学位论文全文数据库》给予出版，并同意在《中国博硕士学位论文评价数据库》和CNKI系列数据库中使用，同意按章程规定享受相关权益。论文级别：■硕士□博士学科专业：生物工程论文题目：烯键还原酶的固定化与应用

4、研究作者签名：指导教师签名：年月日作者联系地址（邮编）：作者联系电话：摘要烯键还原酶的固定化与应用研究烯键还原酶（enoatereductases，ERs）是一种具有潜在应用价值的酶类，属于“老黄酶”家族（“oldyellowenzyme”family），广泛分布于微生物和植物中。它能够选择性地还原α，β-不饱和化合物中的碳碳双键，如不饱和醛、酮、硝基烯及其衍生物，催化得到的饱和醛、酮等化合物是农药、食品添加剂和医药的关键中间体。虽然利用ER催化反应具有环境污染少和反应条件温和等优势，但应用中存在一些的问题，如ER在催化反应中消耗昂贵的

5、辅酶和酶较差的稳定性等。针对以上问题，本论文利用三种不同的固定化方法实现了催化反应中的辅酶循环再生，并显著提高了ER的稳定性，它们分别是交联酶聚集体（cross-linkedenzymeaggregates，CLEAs）、仿生固定化（biomimeticimmobilization，BI）和纤维素载体共价固定化（cellulosecovalentimmobilization，CCI）。在交联酶聚集体共固定化酶（ER-GDH-CLEAs）的制备过程中，优化的最佳条件分别是：沉淀剂硫酸铵浓度为4M、交联剂葡聚醛浓度为15%（v/v）、ER和

6、葡萄糖脱氢酶（GDH）的酶量是11U和50U。在此制备条件下，ER-GDH-CLEAs的固定化效率是94.2%，其中ER和GDH的活力回收率分别为44.1%和18.8%。不同条件制备的ER-GDH-CLEAs在扫描电镜（SEM）中显示出不同的结构特征。SEM显示使用葡聚醛相比戊二醛，制得的固定化酶具有多孔性，添加牛血清白蛋白（BSA）进一步增加了这种趋势。结合实验数据发现多孔性的结构可能更加利于底物与酶接触。固定化酶的热稳定性显著提高，如50℃热处理8h后，ER-GDH-CLEAs中ER相对初始活力保持65.2%，而游离酶仅9.2%。此

7、外，ER-GDH-CLEAs的重复使用性表现十分优异，经过14次重复使用后仍保留114%的相对活力，高于100%的原因可能是酶蛋白在使用中，蛋白的空间构象发生了变化。在仿生共固定化酶（ER-GDH-SPs）的制备过程中，优化的最佳条件分别是：前驱体原硅酸四甲酯（TMOS）浓度为1M、缓冲液是磷酸缓冲液（50mM，pH7.0）、固定化时间为2h、ER和GDH的酶量是14U和50U。在此制备条件下，ER-GDH-SPs的固定化效率是94.7%，其中ER和GDH的活力回收率分别为44.7%和22.3%。SEM显示ER-GDH-SPs为颗粒状的

8、聚集体，结合实验数据（固定化效率高于94%等）推断酶蛋白被包埋其中。由于酶蛋白覆有纳米氧化硅外层而获得优异的稳定性。如50℃热处理8h后，ER-GDH-SPs中ER保持55.4%的相对活力，而游离酶的活力几