光响应茶皂苷元衍生物阳离子脂质体的制备及其抗菌活性研究

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1、硕士学位论文光响应茶皂苷元衍生物阳离子脂质体的制备及其抗菌活性研究作者姓名杨谦学科专业生物化工指导教师叶勇教授所在学院化学与化工学院论文提交日期2018年6月PreparationofPhotoresponsiveCamelliageninDerivativesCationicLiposomeanditsAntibacterialActivityADissertationSubmittedfortheDegreeofMasterCandidate：YangQianSupervisor：Prof.YeYongSouthChinaUniversityofTechnologyGuangzhou,Ch

2、ina分类号：R93学校代号：10561学号：201520118224华南理工大学硕士学位论文光响应茶皂苷元衍生物阳离子脂质体的制备及其抗菌活性研究作者姓名：杨谦指导教师姓名、职称：叶勇教授申请学位级别：工学硕士学科专业名称：生物化工研究方向：天然产物的活性研究论文提交日期：2018年4月24日论文答辩日期：2018年6月4日学位授予单位：华南理工大学学位授予日期：年月日答辩委员会成员：主席：涂伟萍委员：胡剑青、叶勇、邹华生、龙新峰摘要抗生素是一种常用的治疗病原微生物感染的药物，然而长期的大量使用抗生素已经造成细菌产生耐药性，治疗效果显著下降，因此开发一种安全、高效、绿色的抗生素替代品已经成为

3、时下十分迫切的任务。本文通过将油茶皂苷元分离纯化、结构修饰和采用纳米制剂技术，开发一种新型高效、稳定和控释的抗菌剂并揭示其抗菌机制。具体的研究内容和成果如下：（1）采用超滤-反渗透串联大孔吸附树脂对茶皂素粗品进行纯化，得到的油茶皂苷纯度为91.62%，然后分别经过碱水解和酸水解，得到的水解粗产物采用氯仿萃取，无水乙醇/水混合溶剂重结晶，得到浅黄色茶皂苷元粉末，并通过红外、核磁确定其结构。（2）以茶皂苷元为原料，通过酰化反应合成19个茶皂苷元衍生物并通过红外、核磁和高分辨质谱确定其结构。采用微量稀释法分别测定茶皂苷元及其衍生物对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的细菌生长抑制率和最低杀菌浓度，采用结晶紫染

4、色法测定其细菌生物膜生长抑制率，结合三维定量构效关系（3D-QSAR）分析，结果表明茶皂苷元衍生物的活性得到显著提高，其中芳环、杂环基团修饰抗菌活性更强，而且修饰基团的间位和对位引入强吸电子基团有利于提高活性。通过扫描电镜和透射电镜对细菌形态的观察发现，茶皂苷元及其衍生物能够破坏细菌正常的细胞结构，随后研究其对细菌生物膜完整性的影响，进一步证实了其对细胞膜的破坏作用。分子对接结果表明茶皂苷元及其衍生物与细菌甘露醇脱氢酶具有显著的相互作用，有利于其减少细菌的耐药性。（3）以磷脂酰乙醇胺为原料，采用均相反应合成N-马来酰胺-磷脂酰乙醇胺；通过异相反应，将N-马来酰胺-磷脂酰乙醇胺接枝于羧甲基壳聚糖

5、氨基，经过透析法纯化，得到一种新的载体材料CMC-g-SPE，经过红外和核磁确定其结构，元素分析表明其接枝率为87.89%。（4）采用薄膜分散法，以CMC-g-SPE和大豆卵磷脂为囊材，以脱镁叶绿酸a为光敏剂，制备一种光响应茶皂苷元衍生物（S-16）阳离子脂质体。以包封率、粒径和电位为评价指标，对脂质体处方优化，得到脂质体粒径为189.23±1.11nm，电位为18.80±2.37mV，包封率为83.52±1.53%，载药量为2.83±0.05%。光响应阳离子脂质体的体外累计释放曲线表明其具有红光控释作用，由于羧甲基壳聚糖表面修饰，脂质体相变温度和表面亲水性得到显著增加，从而提高其稳定性。（5

6、）基于微量稀释法研究光响应茶皂苷元衍生物（S-16）阳离子脂质体的体外抗菌I活性。结果表明，红光光照下可以显著提高光响应阳离子脂质体抗菌活性，而且光响应阳离子脂质体和茶皂苷元衍生物通过利用不同的抗菌机制产生协同抗菌作用。通过红细胞溶血和HeLa细胞毒性对光响应阳离子脂质体安全性进行考察，当其浓度低于32μg/mL无红细胞溶血性，低于4μg/mL无细胞毒性，因此其抗菌活性在安全范围内。通过观察光响应阳离子脂质体与细菌的相互作用和对细菌形态的影响发现，光响应阳离子脂质体能够破坏细菌细胞膜和细胞壁的结构，应用核酸探针观察其对细菌细胞膜完整性的影响，进一步证明其对细胞膜具有破坏作用，且其对处于生长期和

7、静止期的细菌均具有较强的抗菌活性。关键词：油茶皂苷元；酰化反应；光响应；阳离子脂质体；抗菌活性IIAbstractAntibioticsarecommonlyappliedinthetherapyofpathogenicmicroorganisminfection.However,theantimicrobialresistancecanbeeasilyacquiredduetolong-term