巨细胞病毒感染合并缺锌导致先天性耳聋的作用机理研究

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1、华中科杖夫学同济医学院李丹博士学位论文中文摘要己有大量文献报道，入巨细胞病毒(HumanCytomc8，tiovirus，HCMV)宫内感染垂直传播及母体内血清锌缺乏均可导致新生儿头小畸形、视网膜脉络膜炎、血小板减少症、听力渐进性损伤及智力障碍等迟发性中枢神经出生缺陷，严重影响婴幼几的健康质量。巨细胞病毒大多数在临床上呈不显性或潜伏感染的特点，已有研究表明，病毒基因组在潜伏期只限于表达立即早期的基因产物，巨细胞病毒立即早期基因的转录和表达受CMV增强子调控，巨细胞病毒增强子结构的复杂性及可结合蛋白的多样性可能有利

2、于巨细胞病毒在不同细胞类型(分化、未分化)及生理条件下繁殖。近年来，机体微量元素锌缺乏与病毒感染之间的关系及其机制逐渐成为国内外研究热点，提出了微量元素锌与病毒基因的复制密切相关，与病毒感染后机体的预后密切相关，但锌与病毒之间的具体作用位点和机制尚不清楚，因此，本课题就微量元素锌与巨细胞病毒之间的相关性设计了细胞、动物模型和临床等四个部分的系统研究，旨在揭示巨细胞病毒感染合并缺锌导致出生缺陷的作用机理。研究的第一部分用巨细胞病毒感染不同锌浓度的细胞，从观察细胞的超微形态、细胞的病毒感染率、细胞线粒体膜电位的改变、

3、凋亡因子的变化及细胞线粒体介导的凋亡率等方面来探讨细胞内不同浓度锌水平时对巨细胞病毒感染率及对宿主细胞凋亡的影响及其分子机制；在第二部分用含有CMV立即早期基因增强子及启动子带荧光素酶(Luciferase。LUC)报告基因表达的pRL-CMV质粒转染不同锌浓度水平的细胞，观察其转染效率，进一步来探讨锌作用于巨细胞病毒的具体部位及细胞内锌处于不同水平时对巨细胞病毒立即早期基因增强子／启动子活性的调节作用；在第三部分建立宫内巨细胞病毒感染合并缺锌的动物模型，观察出生后的小鼠脑干诱发听觉电位的变化、耳蜗组织的病理改变

4、、相关因子的变化，探讨巨细胞病毒感染合并缺锌可能产生的出生缺陷及其作用于耳蜗的具体部位，揭示巨细胞病毒感染合并缺锌所致的先天性耳聋的组织病理改变和发病机制；在第四部分通过临床检测巨细胞病毒感染的妇女体内血清锌值含量、观察巨细胞病毒感染者加用补锌治疗后的HCw—IgM转阴率、SOD、MDA的变化进一步证实细胞内锌水平与巨细胞病毒感染的相关性、缺锌对巨细胞华中科技大学同济医学院李丹博士学位论文病毒感染治疗预后的影响及加用补锌治疗后HCMV--IgM转阴率的观察及其机制，从而为机体巨细胞病毒潜伏感染及激活导致先天性耳聋

5、的预防和治疗提供实验依据，为临床进行早期预防和治疗，减少出生缺陷的发生率寻找新的突破口。第一部分细胞内不同锌水平对巨细胞病毒感染宿主细胞线粒体介导凋亡的影响及分子机制目的TPEN是一种锌螯合剂，可以影响细胞内的锌水平。本文用巨细胞病毒感染不同锌浓度水平的细胞，观察绍胞的超微形态、病毒感染率、细胞线粒体膜电位、凋亡因子及凋亡率，探讨锌对巨细胞病毒复制增殖的影响和细胞内不同锌水平对巨细胞病毒感染宿主细胞线粒体介导凋亡的作用及分子机制。方法用锌含量终浓度为5umol／L(缺锌组)、20umol／L(正常对照组)、40p

6、mol／L(卒F锌组)的培养基在体外培养人胚肺细胞24h，分别加入IOOTCID。的病毒干预72h，砌阿法检测细胞病毒感染率：用电镜观察细胞的超微形态病变：流式细胞仪检测备组细胞的凋亡率；共聚焦显徼镜检测各组细胞的线粒体跨膜电位(△Ⅲm)：westernblot检测各组细胞Ctyc的表达：RT—PCR(逆转录聚合酶链反应)检测各组细胞bcl一2mRNA及baxmRNA的表达。结果1．MTT结果显示正常对照组平均吸光值为0．047___0．003，病毒组平均吸光值为0．026_+0．003，缺锌病毒组平均吸光值为0

7、．015±0．002，补锌病毒组平均吸光值为0．032_+0．002。方差分析显示，组间有极显著差异(F=217．838，P

8、率为13．57±0．43四组间有显著差异(F=1538．163，P