TIEG+siRNA对AGEs介导肾小管上皮细胞Smad信号通路的影响

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1、中山大掌硬士学位论文：TIEGSiRNA对AGEs介导肾小蕾上皮细胞S眦d信号通路的影响TIEGsiRNA对AGEs介导肾小管上皮细胞Smad信号通路的影响专业名称：内科学学位申请人：沈晶导师：孙辽中文摘要病理状态下，转化生长因子．B(TGF．B)是最强的致纤维化生长因子，TGF．B主要通过细胞内Smad信号蛋白介导其生物学效应，其中受体调节Smad(Smad2，Smad3)发挥正性调节作用，抑制性Smad(Smad7)发挥负性调节作用。研究表明TGF．B／Smad信号通路活化参与了肾小管上皮细胞转分化和细胞外基质的合成，在糖尿病肾病肾脏纤维化进程中

2、发挥重要作用。TIEG(TGF．B诱导早期基因)蛋白属于SP1样蛋白家族的新成员，是TGF．B诱导的早期转录因子蛋白，参与调节TGF．B靶基因的表达。TIEG一方面通过与Smad7启动子中的GC序列相结合，抑制Smad7表达；另一方面通过促进受体调节性Smad2的表达，从而增强TGF．B／Smad信号通路活化。因此，下调TIEG表达可望通过抑制TGF．B／Smads信号通路活化，改善糖尿病肾病肾间质纤维化进程。本课题通过RNA干扰技术沉默TIEG基因，旨在探讨其中山大尊顷t哇鼻位论文：TIE6siRNA对AG；Es介习。肾小蕾上虞细胞Smad信号通路

3、的影响对终末期糖基化终产物(AGEs)介导肾小管上皮细胞TGF．B／Smad信号通路活化的影响。第一部分TIEGsiRNA慢病毒载体的构建和筛选摘要目的：构建和筛选具有高效TIEG基因沉默的psiRNA．TIEG慢病毒载体。方法：(1)针对TIEG基因设计三条siRNA序列，设计相应含有BamHI和EcoRI酶切粘性末端的双链DNA；(2)pshRNA—copGFP—lentivector质粒BamHI和EcoRI双酶切后与双链DNA连接，构建含目的基因的慢病毒载体psiRNA—TIEG：(3)重组质粒psiRNA—TIEG转化感受态DH5Q细菌，含

4、氨苄青霉素的培养基进行阳性克隆筛选、测序；(4)Lipofectmaine2000转染质粒效率的鉴定；(5)荧光PCR方法鉴定转染VEC细胞目的基因的沉默效率。结果：(1)阳性克隆测序结果与genebank大鼠TIEG基因序列(NM03135)相符：(2)Lipofectmaine2000转染试剂的转染效率达80％；(3)三条siRNA序列均有不同程度的基因沉默效应，其中2号沉默效率最高，可达80％以上。结论：成功构建和筛选出具有高效TIEG基因沉默效应的TIEGsiRNA慢病毒载体psiRNA．TIEG。第二部分TIEGsiRNA对AGEs介导肾小

5、管上皮细胞Smad信号通路的影响Ⅱ中山大掌司l哇哇鼻位论文：TIEGsiRNA对AGEs介导肾小蕾-t戚细胞Smd信号通路的影响摘要目的：观察TIEGsiRNA对AGEs介导肾小管上皮细胞Smad信号通路的影响。方法：(1)AGEs对体外培养正常大鼠近端肾小管上皮细胞(Ⅲ<52E)Smad信号通路的影响：体外培养NRK52E细胞，无血清化24h后给予AGE-BSA或牛血清白蛋白(BSA)刺激24h和48h，收集细胞。采用免疫细胞化学、PCR和Westernblot的方法测定NRK52E细胞TIEGmRNA、Smad2和Smad7mRNA、Smad2和

6、Smad7蛋白表达水平。(2)TIEGsiRNA对AGEs介导NRK52E细胞Smad信号通路的影响：体外培养NRK52E细胞，分别转染psiRNA．TIEG和空载体，然后给予AGE—BSA刺激24h和48h，收集细胞，采用免疫细胞化学、PCR和Westernblot的方法测定转染NRK52E细胞TIEGmRNA、Smad2和Smad7mRNA、Smad2和Smad7蛋白表达水平。结果：(1)AGEs以时间依赖方式上调TIEGmRNA表达，48h达高峰；与刺激前和BSA对照组比较，刺激24h和48h明显上调Smad2和Smad7mRNA和蛋白表达。(

7、2)siRNA-TIEG可有效下调AGEs介导的TIEGmRNA表达。与空载体比较，siRNA—TIEG可下调AGEs刺激24h和48h后Smad2mRNA和蛋白表达，上调Smad7mRNA和蛋白表达。结论：AGEs可介导NRK52E细胞TIEGmRNA异常高表达，TIEG基因沉默通过下调Smad2表达及上调Smad7表达，抑制AGEs介导的NRK52E细胞Smad信号通路活化。关键词：RNA干扰；肾小管上皮细胞；TIEG；TGF-B／Smad信号通路m中山大学硕士掌位论文：TIBGsiRNA对AGEs介导霄·小管上坡细胞Smd伯．号通路的影响The

8、functionofTIEGsiRNAtoepithelialcellsmediatedbyAGEsinSm