smad信号通路介导bmp-7调控大鼠肝星状细胞活性

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1、三峡大学硕士学位论文ADissertationSubmittedinPartialFulfillmentoftheRequirementsfortheDegreeofMasterofMedicineBMP-7counteractsTGF-β1viaSmad-dependentSignalingpathwayinRatHSCsGraduateStudent:ShiHuiMajor:ImmunologySupervisor:Prof.XiaoHejieProf.LiuChangbaiChinaThreeGorgesUniversityYic

2、hang,443002,P.R.ChinaJune,2013三峡大学硕士学位论文三峡大学学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果，除文中已经注明引用的内容外，本论文不含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体均已在文中以明确方式标明，本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。学位论文作者签名：日期：三峡大学研究生知识产权承诺书本人承认：我作为三峡大学硕士研究生在校学习期间，在导师指导下，依据研究工作所作学位论文的知识产权全部权归三峡大学

3、所有。本人承诺：我有义务维护三峡大学的知识产权，凡是以我本人学位论文内的全部或部分研究成果，或实验数据为基础所形成的研究论文及成果，无论是以何种形式刊发学术论文、进行成果鉴定或申报奖励，均以三峡大学为第一作者单位或完成单位，并事先征得导师或学校相关部门的同意。我愿承担因违背上述承诺而引起的一切法津和经济后果。学位论文作者签名：日期：I三峡大学硕士学位论文内容摘要目的：研究大鼠肝星状细胞中Samd1、P-Smad1及纤维化相关基因E-cadherin、α-SMA、col1A2等的表达情况，探讨BMP-7在肝纤维化发生发展过程中如何拮抗TG

4、F-β1，阐述其抗肝纤维化机制。方法：(1)体外培养大鼠肝星状细胞（HSC-T6），采用脂质体转染法将组成性激活化型BMP-7Ⅰ型受体突变体（ALK3-CA）的真核表达载体pcDNA3-HASL-ALK3转染HSC-T6，用逆转录聚合酶链反应（Reversetranscription-polymerasechainreaction,RT-PCR）筛选克隆细胞株；(2)四甲基偶氮唑盐[3-(4,5-Dimethyl-thiaoly)-2,5-diphenyl-2Htetrazoliumbromide,MTT]法检测高表达持续活化型ALK3

5、后HSC-T6增殖；(3)RT-PCR检测col1A2等基因的mRNA表达；(4)蛋白印迹(Westernblotting,WB)法分别检测Samd1、P-Smad1、E-cadherin、α-SMA、col1A2的表达；高倍显微镜下观察高表达持续活化型ALK3克隆细胞株细胞形态。结果：(1)RT-PCR结果表明阳性克隆株细胞的α-SMA、col1A2、col3A1、col4A2mRNA表达水平明显下调，而E-cadherin水平上调。(2)WB结果表明阳性细胞株P-Smad1、E-cadherin表达水平升高，α-SMA、col1A2

6、表达下降，Smad1未见明显改变，以β-actin作为内参照。(3)MTT法结果表明高表达持续活化型ALK3能抑制HSC-T6细胞增殖的速度。与0h相比，当培养24h时ALK3-16/T6和对照细胞3.1/T6增殖倍数分别为1.5和2.6倍；当培养48h时，对照细胞增殖倍数为4.3倍，而ALK3-16/T6细胞为1.7倍（*,P<0.05）；随着时间的延长，ALK3-16/T6细胞增殖速度较对照细胞要慢（*,P<0.05）。因此高表达持续活化型ALK3受体后可抑制HSC-T6细胞的增殖，并且具有时间依赖性。(4)倒置显微镜下，对照组3.

7、1/T6细胞呈单层生长，细胞多呈梭形排列，胞质薄而透明，核椭圆；ALK3-16/T6细胞成多角形或蝌蚪形，胞质饱满，核圆大。结论：成功获得高表达持续活化型ALK3克隆细胞株，运用实验室各种技术方法结果提示BMP-7通过增强Samd1磷酸化水平而竞争性拮抗TGF-β1致纤维化作用。BMP-7或者ALK3可作为临床治疗肝纤维化治疗和预防的潜在靶点。关键词：骨成形蛋白7；Smadl；磷酸化Smadl；肝星状细胞IIⅡ三峡大学硕士学位论文AbstractObjective:TostudytheexpressionofSamd1,P-Smad1a

8、ndfibrosis-relatedgenes,suchasE-cadherin、α-SMA、col1A2andsoon.AtthesametimeinvestigatehowBMP-7antagonize