CD4+CD25+调节性T细胞在乙肝疫苗弱无应答中的作用及机制研究

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1、第三军医大学硕士学位论文CD4+CD25+调节性T细胞在乙肝疫苗弱／无应答中的作用及机制研究摘要乙型肝炎病毒(h印atitisBvims，船V)是一种非细胞毒性DNA病毒，侵入机体后可引发特异性免疫反应，引起肝脏的急性或慢性病理损伤。据世界卫生组织统计，目前全球将近有3．5亿乙肝病毒携带者，每年约有>25万人死于乙肝病毒感染的相关疾病，而且这种死亡率正逐年增加。因此，针对乙肝病毒有效的免疫疗法是全世界关注的热点问题。我国是一个乙肝大国，有许多人正遭受着乙肝病毒的困扰，要做到有效地控制乙肝病毒感染，首先要做好预防工作。近20年来，对于预防乙

2、肝病毒最有效和传统的路线就是注射保护性的乙肝表面抗原疫苗。但是，据调查统计在按照常规的O、1、6月程序对健康者进行全程免疫之后，仍会有5％～10％的接种者抗体始终阴性或达不到保护阈值(抗体滴度<10删L)，表现为弱应答或无应答，重新成为乙肝病毒的易感者，这种现象称为疫苗免疫失败，但是目前对于这种机理尚不十分清楚。许多学者经过多年研究，证实乙肝疫苗免疫失败与众多因素有关，如疫苗本身的抗原纯度、疫苗的剂量、疫苗的灭菌方法、疫苗是否严格按冷链要求贮运，疫苗的接种部位、接种途径、接种次数，以及接种者的年龄、性别、新生儿接种者的出生体重等有关。但是

3、在消除了上述因素之后，乙肝疫苗免疫失败的现象仍无法避免。后来，有人提出这种无应答现象是否是由于体内的APC细胞功能缺陷不能够有效地捕获、加工和递呈皿sAg或者是由于B7共刺激分子的表达缺陷而导致机体免疫功能下调以及髓sAg抗原特异性的T细胞克隆丢失等，但是这一系列假设在后来的实验中都逐一被否定了。机体依靠复杂的免疫网络系统发挥免疫功能，既能通过正向调节对抗原刺激产生应答，又有一套负向调节机制来限定免疫应答的范围、作用程度及持续时间。这些负向调节机制主要通过胸腺T细胞阴性选择导致中枢耐受以及免疫无能、免疫忽视等导致的外周耐受。然而近年来，对

4、于CD4+CD25+调节性T细胞(CD4+CD25+regulatoryTcell，简称Treg)的研究并发现这是一群具有免疫抑制功能的细胞，对维持机体内环境稳定和维7第三军医大学硕士学位论文持自身免疫耐受起重要作用，能够通过主动的方式抑制免疫系统对自身和外来抗原的应答，进而成为免疫学领域以及临床研究的热点。目前，Treg在自身免疫性疾病、肿瘤和器官移植方面研究比较深入，已经证实它能够通过抑制其他CD4+T细胞和CD8+T细胞的活化和增殖来抑制机体的免疫应答。有研究报道，在慢性乙肝患者体内检测到一群持续升高比例的Treg，并且这群耶V特异

5、性Treg能够通过抑制CD8+T细胞的增殖而下调机体抗病毒免疫，从而导致慢性感染。并且，还有一系列报道证实了CD4+CD25+Treg细胞能够通过抑制1．1l细胞而抑制B细胞的活化和分化。其中，Seo等的研究表明CD4+CD25+Treg细胞通过抑制Th细胞从而抑制自身应答性抗．dsDNAB细胞的活化。在正常BALB／c小鼠体内存在着自身应答性抗．dsDlqAB细胞，该细胞处于无能状态，当给该小鼠输入Th细胞后，抗．dsDNAB细胞得到辅助，B细胞开始活化、增殖，并分化成浆细胞产生抗体。然而，当同时输入Th细胞和CD4+CD25+Treg

6、细胞后，抗．dsDNAB细胞虽然活化、增殖，却不能分化为浆细胞产生抗体。HyungW．L妇等研究发现在人的淋巴器官扁桃体中，Treg细胞可以在趋化因子的作用下，移行至扁桃体生发中心，通过抑制GC．Th细胞，而下调生发中心Th依赖的B细胞应答，包括B细胞的存活、B细胞活化后诱导的胞嘧啶脱氨酶的表达和免疫球蛋白产生。基于以上的研究背景，我们提出假设，乙肝疫苗弱／无应答现象是否与此类细胞相关，在乙肝疫苗弱／无应答者体内Treg频率是否上调，并且这群Treg细胞是否具有皿sAg抗原特异性，是否能够通过抑制Th细胞而影响Th依赖的B细胞抗体应答，从

7、而导致机体的这种抗体弱／无应答现象的发生。由于近年来已逐渐证实CD4+CD25+双阳性的T细胞并非真正意义上的调节性T细胞，CD25是T细胞活化的标志之一，CD4+CD25+双阳性的T细胞中也包含了一部分活化的CD4+T细胞。对于定义Treg细胞，目前晟为肯定的金标准就是FOXP3的表达，F0Ⅺ，3是FOX(舶姓eadbox)转录因子家族的一名成员，特异地高表达于CD4+CD25+调节性T细胞上，介导调节性T细胞发育及功能的维持，可反映CD4+CD25+调节性T细胞的活性水平，因此把CD4+CD25+FOⅪ，3+的T细胞定义为真正意义上的

8、调节性T细胞。因此，我们通过流式细胞仪技术检测乙肝疫苗弱／无应答者外周血中的CD4+CD25+T细胞的频率，通过RT．PCR实验检测了弱／无应答者外周血PBMC中FOⅪ，3的mRNA表达情况，