大肠杆菌HPI毒力岛irp1与irp2基因的研究

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1、扬州大学硕士学位论文大肠杆菌HPI毒力岛irp1与irp2基因的研究姓名：董炳敏申请学位级别：硕士专业：预防兽医学指导教师：徐建生;成大荣20100501董炳敏大肠杆菌HPI毒力岛irpl与irp2基因的研究中文摘要高致病性毒力岛(HPI)是耶尔森菌中一个35,-45kb的基因组，携带的基因与铁载体一耶尔森杆菌素合成、调节和转运有关。研究表明，HPI存在于多种肠道杆菌中，如大肠杆菌、沙门氏菌、克雷伯菌等，HPI可能是通过基因的水平转移在不同种属中分布。耶尔森菌的HPI有一个功能核心区，包括了11个基因，其中irpl和irp2为铁调节基因，仅在致病菌中表达，编码的两种高分子量蛋白HMWPl

2、和HMWP2参与铁载体的合成，诱导鼠疫菌素受体和铁载体表达，与耶尔森菌的铁摄取能力有关。HPI不仅赋予病原体特殊的致病力，与感染过程有关，而且在细菌进化过程中扮演重要角色。本研究选择从江苏地区临床分离的HPI阳性大肠杆菌，根据已发表的基因序列，设计卸J与irp2基因的特异性引物，经PCR扩增获得目的片段后，插入到pUCm．T载体获得重组克隆pUCm．irpl、pUCm．irp2，经酶切鉴定，测序分析正确后回收目的片段，与表达载体pGEX一6p一1片段连接，获得重组质粒pGEX—irpl、pGEX—irp2，转化入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞。重组菌在37℃经IPTG诱导表达后，裂

3、解物经SDS．PAGE分析证明，含重组质粒pGEX．irpl和pGEX-irp2的重组菌能够表达分子量分别为41kD和40kD的融合蛋白GST-HMWPl和GST．HMWP2。可溶性蛋白经GSH．Sefinose纯化后纯度达95％以上，用纯化好的蛋白免疫新西兰兔，制备抗GST-HMWPl和GST-HMWP2血清，为进一步研究该蛋白的免疫学功能提供了条件。为深入研究irpl和irp2基因与HPI毒力岛的毒力相关性，本研究应用Red／ET同源重组技术对目的基因irpl、irp2进行了敲除。根据目的基因irpl、irp2和FRT．PGK．gb2．neo．FRT的序列设计一对引物扩增同源臂。第一

4、步电转化将pRedET诱导表达质粒电转化入$793103和$711100的感受态细胞中，30℃培养；L．阿拉伯糖诱导Red／ET重组蛋白的表达，第二步电转化将扩增回收好的同源臂电转化入诱导后的感受态细胞中，ET重组体插入到功能区进入靶部位发生同源重组。关键词：高致病性毒力岛；irpl；irp2；同源重组扬州大学硕士学位论文AbstractHigh—pathogenicityIsland(HPI)ispresentinpathogenicyersinia．This35to45kbislandcarriesgenesinvolvedinsynthesis，regulationandtrans

5、portofthesiderophoreyersiniabactin．Thestudyindicated，theHPIappearstobewidespreadinvariousenterobactiastrains，forexample，E．colistrains，SalmonellaandKlebsiella，ere．HPImaybedistributedinvariousspeciesthroughhorizontalgenetransfer．HPIcontainsacoreregioncomposedof1genes，irplandirp2areironregulatorygen

6、esencodetwoiron-repressiblehigh—molecularmassproteinsdesignatedHMWP1andHMWP2，whichareinvolvedintheabilityofironintake，andexpressedonlyinpathogenicbacteria．HPIisnotonlyattributedtothepathogenicityofbacteriaandspecificphasesoftheinfectionprogressbutalsoplaysanimportantroleintheevolutionofbacterium．

7、InthisresearchtheHPI—positiveE．coliisisolatedfromJiangsuarea．Twopairsofprimerweredesignedaccordingtothepublishedgenesequencesofirplandirp2forPCRamplificationandgotthetargetfragments．ThePCRproductsweresubclonedintothepU