耶尔森强毒力岛(hpi)在禽大肠杆菌中水平转移及功能评价

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1、AnhuiAgriculturalUniversityMasterDissertationTheHorizontalTransferandtheFunctionEvaluationofHPIinAvianE.coliCandidate:JiHuiSupervisor:Professor.QIKe-zongAcademicDegreeappliedfor:MasterofAgricultureMajor:BasicVeterinaryScienceDirection:AnimalPathologyandBiologicalControlCollege:Aca

2、demyofAnimalScienceandTechnologyJune2013国家自然科学基金资助项目：《禽源致病性大肠杆菌HPI毒力岛缺失株构建及其致病性研究》项目编号30871851摘要耶尔森强毒力岛(HPI)是发现于耶尔森菌属染色体上的成簇基因区域，具有典型的毒力岛特征，主要包含与铁摄取有关的毒力基因簇，即耶尔森杆菌素(yersiniabactin,Ybt，铁载体)基因及其调控基因，行使对铁的摄取功能。HPI的结构特征及其在肠道杆菌中的广泛分布提示其可能存在水平转移，而有关禽大肠杆菌HPI在低温低铁共培养条件下的水平转移尚未见报道。有研究表明，大肠

3、杆菌中HPI主要具有铁摄取与调节功能，可赋予细菌毒力和致病性，但对于宿主菌获得HPI后的功能变化仍未见报道。为探讨HPI在禽大肠杆菌中的分布、转移特点及其在受体菌中的功能，本研究对禽大肠杆菌临床分离中HPI的分布情况进行分析；选择合适的分离株作为HPI转移的供、受体，低温低铁条件下共培养后筛选转移阳性株；对比HPI转移前后受体菌的生物学活性变化，初步研究HPI在禽大肠杆菌中转移特性和功能，为进一步明确HPI在大肠杆菌中的分布特性及其与禽大肠杆菌致病性的关系提供一些基础。具体研究内容和结果如下：+1、禽大肠杆菌临床分离株中HPI的分布及HPI株相关性分析以临

4、床分离的禽大肠杆菌的基因组DNA为模板，设计并合成irp2、fyuA、intB和ERIC基因的特异性引物，应用所建立的PCR方法检测临床分离株中HPI的携带情况及各HPI阳性株间基因型相关性，同时对比分析各HPI阳性株中所携带irp2和intB基因的相关性，结果40株禽大肠杆菌分离株中有7检出HPI，阳性率为17.5%，有一株阳性株存在fyuA缺失；对HPI阳性株基因型相关性分析结果显示，7株大肠杆菌的基因型之间存在较大的差异，说明HPI可存在于多个基因型的大肠杆菌中；对HPI阳性株irp2和intB基因相关性分析发现，irp2和intB基因总体表现出较高

5、保守性的特点，两个基因均存在菌种间的同源性高于种内的情况。2、禽大肠杆菌中HPI的转移及其供、受体菌的研究选择合适供、受体株，活化后按10%的比例接种于含有0.2mM的LB液体培养基中，4℃培养；依次用氯霉素抗性平板、irp2基因PCR和ERIC-PCR方法检测，筛选HPI转移株；对比分析转移株与受体株基因型的差异，确定HPI转移的受体株；PCR扩增转移株与供体株的intB基因，确定HPI转移的供体菌。结果，从氯霉素抗性平板上检测到HPI阳性菌落，ERIC-PCR对比分析后发现，该菌与受体株AE-a1基因型相似性为100%，与其它菌株差异均在20%以上；I

6、ntI基因检测对比发现，该基因在AE-t和AE-d2中的大小相同，不同于AE-d1。3、HPI的转移对受体菌生长特性和致病性影响的研究分别从以下方面检测HPI的转移对受体菌功能的影响：在96孔细胞培养板中加入LB液体培养基，接入受试菌培养，每隔2小时测菌液OD600并绘制细菌生长曲线，比较转移阳性株和受体株生长曲线的差异；取菌悬液接种于CAS固体平板上，培养到菌落直径不再发生变化，通过CAS平板上的晕圈半径初步检测菌株产铁载体的能力；在LB培养基中加入不同剂量螯合剂，接入等量的菌液，进行铁胁迫实验，比较两株菌的低铁耐受能力；通过检测受体株和转移株对DF-1

7、细胞的侵袭粘附力及其对7日龄雏鸡的致死能力，比较两株菌的毒力差异。生长曲线检测结果显示，AE-a1的生长速度明显优于AE-t；CAS检测结果显示，AE-t产铁载体的能力最强，高于AE-a1，也高于AE-d1；不含有铁螯合剂的培养基中，AE-a1的生长状况要好于AE-t；在铁鳌合剂浓度大于等于0.128mM的培养基中，AE-t的生长速度均高于AE-a1，且在前24h差异显著；细胞粘附侵袭实验和动物毒性实验显示，AE-a1的毒力强于AE-t的毒力，并且差异极显著。以上结果表明，本实验通过低温低铁共培养成功得到HPI转移株，且确定了供、受体菌；因此，HPI在大肠

8、杆菌中存在水平转移，并且可能主要以区域外同源重组的方式进行转移；受