鼠疫耶尔森菌体内外srnas的鉴定与毒力相关srnas初步筛选

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1、分类号UDCR378．6+1612密级坌汪编号—j鱼至皇皇圣1立1垒垒鱼鱼硕士学位论文鼠疫耶尔森菌体内外sRNAs的鉴定与毒力相关sRNAs初步筛选IdentificationofsmallnoncodingRNAsinYersiniapestisinvivoorvitroandscreeningofsmallRNAsassociatedwithvirulence作者姓名：孟祥荣指导教师：黄新祥韩延平教授小组成员：徐顺高副教授生秀梅副教授张海方副教授倪斌讲师申请学位：硕士学科专业：临床检验诊断学论文提交日期：2013年4月26日论文答辩日期：

2、2013年6月9日学位授予单位：江苏大学学位授予日期：2013年6月17日答辩委员会主席：王胜军教授独创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下独立完成的，除文中注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体的研究成果。对本论文做出重要贡献个人和集体，均在文中作了声明并表示谢意。作者签名：孟辩婊日期：芝D廖．多、／‘学位论文版权授予书{l掣Illl2lll12I19ll4till311114114llUI本学位论文作者同意学校保留该学位论文并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权江苏大

3、学可以将本学位论文的全部内容或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。本学位论文属于保密I--I，在年解密后适用本授权书。不保密囱。学位论文作者签名：湫签字日期：20良‘．／6导师签名：签字日期：瑾渤}2刁

4、i6．f易江苏大学硕士学位论文目的：摘要随着高通量测序技术的发展，越来越多细菌中的非编码小RNA(smallnon—codingRNAs，sRNAs)被发现。这些sRNAs不编码蛋白质，而作为基因表达关键调控因子，有利于宿主一细菌之间的相互作用，并在病原体生存的转录后调控中起着关键作用。本研

5、究旨在发现鼠疫耶尔森菌体新的sRNAs及其对毒力影响，揭示鼠疫菌在体外生长和体内感染期间相关sRNAs的表达模式，便于将来研究鼠疫耶尔森菌的sRNAs及其功能。方法：1．RNA测序和信息学分析：分别提取四种条件，TMH培养基、BHI培养基、肺鼠疫模型小鼠肺和小鼠脾内的鼠疫耶尔森菌总RNA，回收50--，500ntRNA片段，进行Solexa测序。经过生物信息学分析，筛选位于基因间区或反义链上，且存在于两个及两个以上样品的转录本，作为候选sRNAs。2．候选sRNAs特征的证实：针对上述获得的候选sRNAs信息，设计相应的特异性引物，经体外转录

6、制备地高辛标记的RNA探针，通过Northernblot实验检测候选sRNAs存在、大小和稳定性：通过引物延伸实验来确定这些高丰度表达sRNAs的转录起始位点。3．候选sRNAs差异表达的证实：每个RNA样品，用特异性引物逆转录成cDNA后进行实时荧光定量PCR(qRT-PCR)，分析比较候选sRNAs在体内外条件下差异表达情况；通过Northernblot实验检测候鼠疫耶尔森菌体内外sRNAs的鉴定与毒力相关sRNAs初步筛选选sRNAs在体外条件下差异表达情况。4．鼠疫菌sRNAs缺失突变株的构建：我们筛选部分高表达的sRNAs，采用九R

7、ed同源重组技术制备鼠疫耶尔森菌sRNAs缺失突变株。5．表型实验和小鼠感染实验：通过观察菌落形态和体外生长，比较鼠疫菌野生株和sRNAs突变株的体外生长相关的表型变化；鼠疫菌野生株和sRNAs突变株分别接种于BHI培养基26。C培养至对数中期，37。C继续培养lhr。大约100个CFU鼠疫菌皮下注射感染6周龄的BALB／c小鼠，观察14天的死亡情况。结果：1．经RNA测序和数据分析，最终发现了104个鼠疫耶尔森菌的非编码sRNAs，包括26个在其他基因组中已经注释的和78个新发现的sRNAs。2．Northernblot实验结果验证了14个

8、新的小RNA存在，转录本长度与RNA测序得到的长度基本吻合，并对sR034等6个sRNAs的大小和稳定性进行了初步验证；引物延伸实验结果表明，成功确定了两个sRNAs(sR034和sR035)的转录起始位点，与RNA测序结果基本一致。3．经qRT-PCR证实，发现CsrB，CsrC，4．5SRNA和sR027等4个sRNAs在感染小鼠肺脏中表达下调。4．成功构建了sR035等9个鼠疫菌sRNAs缺失突变株。5．表型实验证实sRNAssR084、sR035和sR088缺失株菌落呈现光滑表型；小鼠毒力实验证实，已知毒力相关sRNAssrA缺失突变

9、株的毒力减弱，其他5个sRNAs缺陷变异株没有减毒。Ⅱ江苏大学硕士学位论文结论：本研究发现了104个sRNAs，对其基本特征和体内外表达情况进行了初步鉴定。sRNA