基于cdna文库方法的鼠疫耶尔森氏菌srnas的筛选与鉴定研究

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1、江苏大学硕士学位论文基于cDNA文库方法的鼠疫耶尔森氏菌sRNAs的筛选与鉴定研究姓名：纪晓岚申请学位级别：硕士专业：免疫学指导教师：黄新祥20120608江苏大学硕士学位论文摘要背景细菌中发挥调节作用的非编码RNA，称为“调节小RNA”(sRNA)。调节sRNA参与到病原体侵染宿主的应激过程。鼠疫的病原菌一鼠疫耶尔森氏菌(以下简称鼠疫菌)是以蚤类为传播媒介，在啮齿动物间传播的，感染机体后，鼠疫菌能在巨噬细胞内存活繁殖。面对多宿主复杂的环境因素，鼠疫菌必须能够感应并快速适应每个环节的环境变化，才能最终在

2、宿主体内存活和在自然界中传播并最终致病，而每个适应性反应也必然伴随着严格的基因转录调控。依据鼠疫菌在宿主体内可能遇到的胁迫环境，我们采用五个不同体外模拟条件培养鼠疫菌，通过cDNA文库构建的方法来发现鼠疫菌在多种体外条件下表达的sl酬A，试图从整个基因组水平上获得新的、鼠疫菌特异的sRNA，为其功能研究奠定基础。方法本研究旨在鉴定鼠疫菌传播感染过程中参与基因调控的sRNA分子，因此，我们依据鼠疫菌在传播和感染过程中可能面临的环境，设计并实施了多个体外模拟刺激的条件，包括温度、生长时期、铁缺乏(模拟宿主体

3、内低铁环境)、低钙(模拟感染初期III型分泌系统的形成环境)和低镁(模拟巨噬细胞中溶酶体环境)5种刺激因素，对5种条件的鼠疫菌总RNA进行提取，等比例混合后利用胶回收和氯化钠浓度梯度洗脱方法获得50~400nt长度范围的RNA，在RNA分子的5‘和3’端加上特异接头，逆转录后构建cDNA文库。对获得的cD：NA克隆进行S绷琴r测序，对获得的序列进行基因定位，将基因间区或反义链上的序列作为候选sRNA。依据序列与基因的相对位置，对候选小RNA进行分类，每一类中挑选出有代表性的若干sRNA进行Nonhern

4、Bbt和RACE的实验，验证其真实存在性和完整性，并对文库中得到的70nt以上的sRNA进行ReaI-timePCR的定量分析。最后，通过RNA二级结构的预测软件Mf0H对获得的对sRNA进行二级结构的预测。结果通过上述RNA组学的方法和每一步实验操作严格的质量监控，我们发现了43个非编码RNA，其中6个已经注释的RNAs，其中25个为注释基因反义链编基于cDNA文库方法的鼠疫耶尔森氏菌s刚As的筛选与鉴定研究码的的sRN舡。有趣的是，其中2个与非编码RNA完全互补。另外我们还发现了8个新基因间区的sR

5、N舡。Nonhcmbbt成功的验证了lO个候选的sRNAs。29个候选slⅢAs的表达分析显示24个sRNAs在鼠疫菌进入稳定期时高表达。结论本研究将能获得全长RNA序列的凡蛇E技术结合到cDNA文库的构建工作中，因此我们的方法更易于获得真实的、全长的sRNA分子。从获得的结果来看，所用的建库方法是可行的，cDNA文库相对来说比较完整，片段覆盖的范围较广，得到sRNA在文库中所占的比例较大．获得新sRNA的效率较高，并且得到的序列大都是真实可信的。尽管我们给出的鼠疫菌sRNA的信息还不全面，而且还有赖于

6、后续研究的补充甚至更正，但仍然为鼠疫菌基因sRNA的发现及其调控网络的构建及基因功能的预测方面迈出了关键的一步。关键词：鼠疫耶尔森氏菌、sRNA、cDNA文库江苏大学硕士学位论文一———————————————-—————————_——————————-——_—————一ABSTRACTBackgmundS嘲¨I斟A(s对、IA)jss叩po∞dlylnVoIVed．mthe佗guIat．0nofSt他豁respon∞sofpath0萨璐dur．mginfi暑ctbrL拖糟加仞肛剧豇，theetbIog

7、jca萨ntofpIag忻，mu瓯e眦。帅衙tc仃弘斌u他andmic雠nv的nmentchan萨sduring．ts脏style．Hcre，we啪dthecDNAcbningap呻achtodiscover如II．IenglhsRNAcandidatesthat玳h谵hlye冲粑蹴diIIZp删缸underfiVedi行色他ntgmwthcondit．D璐·Me恤O凼OⅢ代search毽inte幢toobtain∞veIhighlyabunda哦sRNAsinZpP盯豇ina嚣∞micscale．TO

8、o侬rano懈view0fsRNAe冲陀豁．DninZp倒豇underdi他佗ntenv的nm。ntaIs噍ses’theor簪nbm、抛sg∞wnundere．thersu妇bIeors骶ss如Icond．tbns．ThcII’wec0璐仃啦tedcDNA胁隔rybycorTlb．mingRACE(忸p订a呷li位atiDnofcDNAends)tcchnjq嗽andRNAs函觚t'Dmtjonp巾tocoLThuS’o呱st例．egyi