肿瘤细胞培养技术-林星石

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1、肿瘤细胞培养技术解放军总医院免疫室林星石研究员Histroy肿瘤类型：间充质上皮神经外胚层造血源性（1955-1958-1963-1965）Invitro:原代传代建系（1967-1970）配基成分：纯血清含血清无血清生物学特性：细胞亚细胞酶和分子肿瘤细胞invitro的特点细胞保持永生性：自我复制形态学：大小不一逐渐一致增殖力更强：DNA合成期、分裂期达50%突变性：不同于正常细胞，失去稳定的控制高分化变低分化表面性状：负电荷数量>正常，贴壁性，抗原性可变异接触抑制减弱或消失：悬浮生长特征：成瘤

2、性：移植到动物体内可成瘤肿瘤细胞invitro培基RPMI1640：最常用，+10~20%FCS，上皮性或悬浮性（+0.03%谷氨酰胺）DMEM：常用F12：适用于上皮性癌，如肝癌，L-15：注意：+2g/LNaHco3或+20mmol/LHEPESpH7.2RPMI1640+F12或L-15（1:1）：适用肉瘤培养液特殊添加剂常用的促细胞生长因子及使用的终浓度添加剂终浓度添加剂终浓度BSA10-5mol/mlEGF5ng/mltransferrin5-10g/mlFGF5ng/mlinsulin5

3、pg/mlNGF5ng/ml氢化可的松10-5mol/ml肿瘤细胞的培养与常规细胞培养技术相同一个细胞群体，存在多种亚群，复杂性建株细胞较正常细胞易于培养细胞分裂增殖的调控（细胞周期）多种基因的协同作用调控因子：基因：Cdc2、cyclin蛋白磷酸化蛋白激酶的调控胸苷激酶的调控负调：DNA损伤与DNA修复：抑制抗性肿瘤细胞细胞间的相互影响不同亚群代表不同分化程度的细胞群表型、形态、受体、对因子的反应等均不同不同亚群释放不同的正负调节因子(阴阳调控)细胞因子与激素对肿瘤细胞的调控一个重要而复杂的因素因素

4、高分化低分化——————————————————胰岛素生长-凝血孝素生长-前列腺素促进（>400)抑制激情素-助黏附维生素A抑制生长及分化____________________________________调整培基中的成分可调控细胞的生长与分化影响培养肿瘤细胞生长的因素PH营养：如血清效价低细胞生长因子的自分泌及旁分泌癌基因抑癌基因的变化排泄废物的影响细胞外基质的作用细胞相互间的作用污染培养技术-取材手术标本活检标本胸腹水穿刺细针头穿刺内窥镜活检关键：新鲜、无菌、及时、准确技术-分离纯化分离：剪碎、

5、酶消化、Ficoll、Percoll等密度沉降分离纯化：反复贴壁去除成纤维细胞自然淘汰去除正常细胞利用特异抗原标志筛选法(panning)分亚型流式细胞仪分选克隆建株高转移株的建立：反复接种技术-培养原代培养：去除纤维细胞及淋巴细胞，防止细菌、真菌污染。传代培养：增殖力低的细胞需要饲养细胞适当密度,基本长满后传代,前10代不稳定，注意培养条件，适当调整培基。技术-鉴定与建株鉴定：组织来源、形态特征、核型染色体分析、生长特性、对细胞因子的反应（TNF)、集落形成、致瘤实验（裸小鼠）建株：生长半年以上，病理

6、诊断、光镜及电镜观察、生长特征、染色体分析、肿瘤标志、致瘤及转移情况注意：不是每一肿瘤组织都能建株应用-肿瘤治疗的研究治疗药物敏感性的鉴定与筛选肿瘤的多药耐药性的鉴定各种新药治疗的实验研究体外：肿瘤的生长（3HTdr掺入）肿瘤的杀伤率（MTT、51Cr释放）体内：裸鼠或免疫功能抑制鼠，成瘤率、抑瘤生长率、转移率、生存时间及死亡率作用机理的研究：基因、蛋白、酶、标志、受体肿瘤细胞培养的应用肿瘤细胞的遗传特性：各种癌基因及抑癌基因的分析、染色体定位（FISH法）肿瘤细胞的生物学行为：细胞周期（FACS)、信

7、号传递肿瘤细胞的标志与激素、受体变化（免疫细胞化学、放射自显影、酶免疫、荧光免疫、放射免疫、免疫印迹）单克隆抗体的制备单克隆抗体的制备基本原理：Bunet抗体选择学说，每个B细胞只能够产生一种针对它的特异性抗原决定簇的抗体。从一个祖先B细胞分裂繁殖形成的纯细胞系，称为克隆。单克隆抗体的制备单克隆抗体定义：来自克隆系的细胞基因完全相同，产生的抗体完全相同。这种从一株克隆系产生的抗体—单克隆抗体（McAb)。1975年Kohler和Milstein首先利用细胞融合技术制备了永久分泌单克隆抗体的杂交瘤细

8、胞株。单克隆抗体的制备特点：肿瘤细胞易体外培养和长期生长；B淋巴细胞分泌特异性抗体；二者杂交融合杂交瘤，继承二者性质。HAT培基：H—次黄嘌呤、A—氨基蝶呤T—胸腺嘧啶核苷单克隆抗体的制备肿瘤细胞DNA合成途径：叶酸衍生物氨基酸、小分子化合物合成DNAHGPRT-TK次黄鸟嘌呤磷酸核糖转移酶胸腺嘧啶核苷激酶核苷酸前体单克隆抗体的制备HAT特点：“A”—叶酸拮抗物骨髓瘤-骨髓瘤：DNA合成途径阻断；缺HGPRT，不能利用“H”—死亡。