肿瘤细胞培养.ppt

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1、肿瘤细胞的培养一、肿瘤细胞培养技术二、肿瘤细胞的培养三、体外培养肿瘤细胞的生物学检测四、肿瘤细胞的冻存、复苏与运输五、总结一、肿瘤细胞培养技术1、取材肿瘤细胞培养材料主要来源于外科手术或活检的瘤组织。取材部位非常重要体积较大的肿瘤组织中央常有退变或坏死区，取材时应去掉坏死组织，故应去瘤体的周围瘤组织做培养，癌性转移的淋巴结或癌性胸腹水是较好的培养材料。取材后应尽快进行培养，如因故不能立即培养，可按正常组织储存方法保存，将组织剪成1mm3左右的小块，放入培养液中，置4℃保存，但存放时间不宜超过24h。取材时应注意无菌操作。类固醇细胞瘤一、肿瘤细胞培养技术2、分离培养液中1mm3

2、的组织块，仅有少量处于周围的细胞可能生存和生长。若要获得大量生长良好的细胞，须将组织分散开，使细胞解离出来。目前分散组织的方法有机械和化学两种，要根据组织种类所需和培养要求，采用适宜的手段。机械法：机械分散发、剪切分离法消化分离法：胰蛋白酶消化法、胶原酶法一、肿瘤细胞培养技术2、分离剪切分离法:在进行组织块移植培养时，可以采用剪切发，即将组织剪或切成小块然后分离培养。步骤：1、首先将经修整和冲洗过的组织块放入小烧杯中，用剪刀反复剪切组织至似糊状。2、用吸管吸取缓冲液或无血清培养液加入烧杯中，反复轻轻吹打，低速离心去上清剩下的组织小块即可用于培养。一、肿瘤细胞培养技术2、分离胰

3、蛋白酶消化法：适用于消化细胞间质较少的软组织，如胚胎、上皮、肝等组织。对传代细胞效果也很好，胰蛋白酶消化效果主要与PH值、温度、浓度、组织块大小和硬度有关。1、将组织块剪切成1~2mm32、加入胰蛋白酶37℃热消化3、过筛200目4、必要时重复5、加入胰蛋白酶冷消化6-24h6、沉淀去上清7、加新的胰蛋白酶37℃消化30min8、过筛9、离心去上清10、加入血清培养基吹打11、计数12、接种瓶培养热消化冷消化共同步骤一、肿瘤细胞培养技术2、分离二、肿瘤细胞的培养1、原代培养我们为何要进行原代培养？1、建立各种细胞系的第一步2、是获取细胞的主要手段3、组织和细胞刚刚离体，生物学

4、特性未发生大变化4、最接近和反映体内生长特性，适合做药物测试、细胞分化等试验原代培养方法有组织块法、消化培养法、器官培养法等。最基本和最常用的是组织块法和消化培养法。二、肿瘤细胞的培养1、原代培养组织块培养法是一种简便易行且成功率较高的常用原代培养方法。即将组织剪切成小块后，接种于培养瓶。培养瓶可根据不同细胞生长的需要作适当处理。例如预先涂以胶原薄层，以利于上皮样细胞等的生长，涂以多聚赖氨酸培养需旺细胞等，适用于组织量少的原代培养。1、取材修剪冲洗2、剪成1mm3小块3、移入培养瓶4、分布组织小块间距5cm5、翻转培养瓶并加入适量培养液，37℃静置2-4h6、翻正培养瓶进行培

5、养7、原代细胞生长二、肿瘤细胞的培养1、原代培养这种方法采用前述的组织消化分散法，将妨碍细胞生长的细胞间质包括基质、纤维等去除，使细胞分散，形成悬液，易于从外界吸收养分和排出代谢产物，可以很快得到大量活细胞，细胞也可能在短时间内生长成片。适用于培养大量组织，原代细胞产量高；但步骤繁琐、易污染，一些消化酶价格昂贵，实验成本高。步骤：1、按消化分离法收获细胞。2、待组织已分散成细胞团或单个细胞，则终止消化，过筛200目过掉组织块，大块组织继续消化。3、收集过滤消化液离心1000rpm/min，5min，去上清加含血清培养液，轻轻吹打形成细胞悬液，计数后接种到培养瓶，置CO2培养箱

6、培养。二、肿瘤细胞的培养1、原代培养器官培养是指从供体取得器官或器官组织块后，不进行组织分离，保持其原有器官的结构和连接，直接将器官或器官的一部分在体外培养，在培养过程中保持器官或其一部分组织的结构和功能。器官培养主要强调器官组织的相对完整性，重点观察细胞正常联系和排列情况下，它们之间的相互影响，和局部环境的失物调节作用等。二、肿瘤细胞的培养2、传代培养肿瘤细胞的传代是人们利用培养肿瘤细胞作为进一步研究的靶材料。细胞性状的好坏直接影响研究的结果。常见肿瘤细胞的传代多指细胞系的传代，大致分为两种：一种是贴壁型细胞传代；另一种是悬浮型细胞传代。注意事项：1、细胞没有生长到足以覆盖

7、瓶底壁的大部分表面以前（80%），不要急于传代。2、不同的细胞有不同的消化时间，因而要根据需要注意观察及时处理。3、吹打细胞时动作要轻巧尽可能减少对细胞的损伤。4、首次传代时细胞接种数量要多一些，使细胞尽可能适应新环境利于细胞生存和增殖。二、肿瘤细胞的培养2、传代培养1、贴壁型细胞的传代步骤：1、选取生长良好的细胞一瓶，轻轻摇晃培养瓶，倒掉培养液，缓冲液洗一遍。2、从无细胞侧加入0.25%的胰蛋白酶，翻转培养瓶，使消化液浸没细胞1min左右。3、翻转培养瓶，放置5-10min，观察细胞出现布纹孔状为止。