肿瘤细胞培养中常用技术

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1、肿瘤细胞培养中常用技术侯桂琴郑州大学药学院内容提要：1.肿瘤发生中的细胞生物学机制2.体外培养肿瘤细胞特点3.肿瘤细胞培养中常用技术①抗癌药物敏感性试验②肿瘤细胞转移体外模型的建立细胞凋亡细胞增殖失控与端粒酶细胞分化侵袭与转移抑癌基因失活原癌基因激活一、肿瘤发生中的细胞生物学机制二、肿瘤体外培养细胞优点：1.免受机体内部因素影响2.可长期保存3.快速筛选抗癌药4.费用低缺点：与体内环境有差异，应结合体内试验肿瘤细胞取材及培养一般取自患者。实体瘤：原发癌组织或转移灶胸、腹腔炎：胸水或腹水白血病：血液或骨髓液注：取材后及时培养勿放置

2、过久常用的肿瘤细胞系1.www.atcc.org2.http://www.181817.com/181817_Category_2073020_1.html（美国ATCC细胞库中国代理）3.http://www.ctcccas.ac.cn/xibao/catalogue.html4.http://www.docin.com/p-19978954.html三、肿瘤细胞培养中常用技术1.抗癌药物敏感性试验2.肿瘤细胞转移体外模型的建立1.抗癌药物敏感性试验美蓝法染料排斥法生长曲线测定法集落形成试验法MTT比色法裸鼠成瘤实验法美蓝法原

3、理：利用活细胞的脱氢酶提供氢离子，使甲烯蓝（美蓝）还原为甲烯白（无色），细胞死亡之后，脱氢酶失活，无法使甲烯蓝还原，因此被染成蓝色，检测用药后的死细胞数能反映药物的抑瘤作用。缺点：假阳性率高台盼蓝排斥试验原理：台盼蓝能使死细胞着色（淡蓝色），而活细胞拒染。活细胞总数×100活细胞率（％）＝活细胞总数＋死细胞总数注意：简单，最常用。染色时间不宜过长生长曲线测定法原理：癌细胞在最适条件下呈指数生长，当细胞处于对数生长期时用于试验，以细胞数的对数与培养时间可得一条生长曲线，比较加药组合对照组细胞生长曲线，可反映出药物对肿瘤细胞生长的影

4、响。dCellnumber(×104)lg计算药物对细胞的杀伤率、药物对细胞倍增时间影响、药物对细胞生长饱和密度影响集落形成试验法原理：肿瘤细胞系由不同比例增殖及分化能力不同的细胞组成，其中含有极少部分具有自我复制和增值能力的干细胞，具有分化和形成集落的特性，约占1%，其与肿瘤治愈、复发或转移密切相关。因其具有分化及形成集落的能力，故用集落法可体外检测抗癌药物敏感性。四唑盐（MTT）比色法商品名为噻唑蓝原理：活细胞中脱氢酶能将四唑盐还原成不溶干水的蓝紫色产物（formazan)，并沉淀在细胞中，而死细胞没有这种功能。二甲亚砜（D

5、MSO）能溶解沉积在细胞中蓝紫色结晶物，溶液颜色深浅与所含的formazan量成正比。再用酶标仪测定OD值MTT法简单快速、准确，广泛应用于新药筛选、细胞毒牲试验、肿瘤放射敏感性实验等。XTT比色法：与MTT类似，但产生的橙黄色甲儹（formazan）溶于水。缺点：水溶液不稳定，需低温保存或现用现配。CCK-8比色法：1.产生的formazan都是水溶性，检测灵敏度更高。2.更加稳定，酚红和血清对其测定无明显影响对细胞无明显毒性，3.加入显色后，可以在不同时间反复用酶标仪读板，使检测时间更加灵活，便于找到最佳测定时间放射性同位

6、素掺入法危险性大，少用裸鼠成瘤实验法（详见下章）裸鼠特点：先天性无胸腺，故胸腺依赖的免疫功能缺乏异种移植无排斥反应，可进行人体肿瘤移植，且形成的肿瘤仍能保留原有组织学形态、特点。应用：1.体外瘤培养细胞株的鉴定2.研究肿瘤在体内的生物学行为3.药物作用机理研究2.肿瘤细胞转移体外模型的建立转移过程：①癌细胞从原发灶脱落，形成转移灶②浸润到靶目标：对靶目标基底膜的黏附、破坏基底膜、浸润。此过程为抑制癌转移药物筛选、开发提供思路。模型主要包括：1）细胞体外黏附实验2）肿瘤细胞迁移实验3）肿瘤细胞侵袭实验4）肿瘤转移试验1）细胞体外黏

7、附实验细胞黏附性：肿瘤细胞通过膜表面受体（整合素、钙粘蛋白和层粘蛋白受体）黏附于基底膜及细胞外基质成分上（如纤维连接蛋白、层粘蛋白和IV型胶原蛋白）。作用：维持细胞外形、调节细胞分裂、运动。黏附是癌细胞侵袭的开始。（1）肿瘤细胞在细胞外基质上黏附的测定原理：高侵袭的肿瘤细胞与基底膜成分的异质性黏附能力通常增高，而肿瘤细胞间的同质性黏附能力则会下降。此特性有利于肿瘤细胞与肿瘤母体的分离，并侵犯基底膜等正常组织。主要试剂：人工重构基底膜材料Matrigel（主要成分为层粘蛋白和IV型胶原蛋白）、纤维连接蛋白（FN）、小牛血清白蛋白（

8、BSA）、MTT。方法步骤：1）包被基底膜2）水化基底膜3）接种并培养细胞4）MTT检测黏附率（%）=[（实验组细胞A值/BSA组细胞A值）-1]×100（2）肿瘤细胞与内皮细胞黏附测定肿瘤细胞与脉管内皮细胞的黏附有利于其在脉管壁着床。原理：利用肿瘤细胞对活性染