肿瘤细胞培养和杂交瘤技术医学课件

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1、安徽医科大学微生物学教研室龚蕴贞肿瘤细胞培养一、肿瘤细胞体外培养的重要性二、癌细胞系的建立三、转化细胞系建立四、癌细胞系和转化细胞系注意事项五、癌细胞系和转化细胞系的鉴定六、癌细胞和转化细胞系建立和鉴定的小结及讨论大纲一、肿瘤细胞体外培养的重要性恶性肿瘤细胞培养建立细胞系，包括癌细胞系和转化细胞系。转化细胞系可以是恶性转化细胞和一般转化细胞两种。恶性转化细胞系和癌细胞系一样具有永久性生长能力和恶性表型，对此二种来源的细胞系鉴定也是相似的，为研究恶性肿瘤提供了有用模型。而一般转化细胞系只具有无限生长能力，不具有

2、恶性细胞的表型，此种细胞系可相似于正常细胞的模型而被应用。癌细胞来源于体内正常上皮细胞。癌细胞在体内或体外一样具有无控制生长和分化不全的特点，因此比正常细胞容易培养建细胞系。如20世纪50年代，国外建立了宫颈癌的Hela细胞系。癌细胞的增殖是按指数方式生长的，自一个癌细胞增殖到能触及的程度要经过30代（109，1cm3,1g）。这样1cm3大小的肿块再经过10代（1012，10cm3，1Kg）。这样的大小和重量时足以致病人于死亡。经治疗后如细胞数从1012减少至1010，重约10g时可称显效或部分缓解；若肿瘤

3、细胞数减少到108或106，重约100mg至10mg时，可认为临床治愈或完全缓解，但仍有可能复发。要根治肿瘤细胞，必须彻底消灭所有癌细胞。外科手术切除大量肿瘤细胞，但转移癌细胞仍有复发的危险。癌细胞的迅速增殖扩散受机体内环境中多种因素的影响如各种生长因子、抑素、激素、多胺、基因调节包括细胞周期基因和癌基因、cAMP和cGMP浓度（前者对细胞增殖负调节，而后者为相反）。正常细胞周期的G1期有一个特殊的调节点—R点，在生长条件不适宜情况下，细胞不能通过调节点而不增殖，细胞通过G1期进入M期前受一种不稳定蛋白质调节

4、通过R点启动DNA的合成，例如抑癌基因P53最重要的生物学功能就是通过调控细胞周期监测点来维持基因组的稳定性，当细胞DNA受损时，P53诱导细胞周期终止或凋亡，而P53突变或缺失使P53功能失活则导致基因组紊乱，产生细胞转化。体内细胞处于不同状态，大概分成三种命运:①继续增殖细胞，不断离开G1期通过细胞周期中不同时期（S、G2、M）完成细胞分裂，如骨髓干细胞，胃肠上皮中的基底细胞等，②不增殖细胞，这类细胞在分裂完成后，暂处于G1期，正常情况下不合成DNA，不进入细胞分裂期，如肝细胞，只有受损或切除时肝细胞再分

5、裂增殖。哺乳动物的初级卵细胞也属于此类。③不增殖细胞，这类细胞由R点走向分化细胞，并执行专门功能的细胞（称终末细胞）如神经细胞、哺乳动物成熟的红细胞、皮肤上皮的角质细胞、多性核粒细胞。肿瘤和正常的组织同样在体内也具有三种不同的细胞群：①增殖细胞群（A）：是肿瘤中处于增殖周期的细胞，与肿瘤生长直接有关，亦是化学疗法最易攻击的部分。②暂不增殖细胞群（B），它是延长了G1细胞或G0细胞，目前不参加细胞周期，与肿瘤的扩大暂时无关，由于它保留着增殖的能力，在一定条件下成为肿瘤复发根源。③不再增殖群（C），它不再参与细胞

6、周期，而日趋衰老，死亡，对肿瘤增长无意义。肿瘤的增长情况取决于3种细胞群的比例，肿瘤增殖率（growthfactorGF）可由下列关系来决定：GF=A／A+B+C。A群细胞越多，B、C群细胞越少，肿瘤恶性程度越高。常应用体外肿瘤细胞培养，模拟体内环境或确定单因素多因素研究肿瘤细胞发生发展结局。观察抗癌药物对细胞周期作用点的影响也常应用肿瘤细胞体外培养。若能确定肿瘤细胞各周期时间，选择各期针对性药物进行治疗，则可以提高疗效。放线菌素D作用于G1期抑制DNA聚合酶合成，作用于S后期与G2期抑制rRNA并影响cAM

7、P水平。放线菌素D不影响非分裂期细胞，因而放线菌素D是一种细胞周期特异性药物。阿糖胞嘧啶，选择性地抑制核苷二磷酸还原酶，阻断核苷酸变为脱氧核苷酸，从而抑制DNA合成，是DAN合成抑制剂，属于S期特异性药物。秋水仙素能与微管蛋白强烈结合，引起微管解体，纺锤体破坏，结果染色体的移动被阻断，细胞分裂停留在中期，它是属于M期的特异性药物。通过体外细胞培养观察抗癌药物对细胞周期作用点将常用的抗癌药物的细胞周期分类。数十年来医生们除用手术外只能用放疗和化学疗法来治疗癌症，这些疗法毫无分别地同时杀死健康细胞和癌细胞，直到人

8、类基因组图谱的解密，我们才迎来了适用少数病人的靶向性治疗新时代，医生们首先分析病人肿瘤中的DNA（基因），再开出靶向性复合药物的药方，专门攻击肿瘤细胞发生缺陷的基因，达到治疗癌症的目的。当前较有前景的靶向治疗①现在发展的基因工程腺病毒（ONYX-015）因删除了E1B55KD蛋白而可以选择性的溶解P53突变或缺失的肿瘤细胞，此类肿瘤细胞占50℅，也就是腺病毒ONYX-015可达到50℅的靶向治疗药物