肝癌相关抗原KINECTIN基因的重组、表达及其致敏DC抗肝癌活性研究

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1、肝癌相关抗原KINECTIN基冈的重组、表达及其致敏DC抗肝癌活性研究中文摘要肝癌相关抗原KINECTIN基因的重组、表达及其致敏DC抗肝癌活性研究摘要目的：(1)了解动力素(kinectin)作为肝癌相关抗原在肝癌细胞株BEL-7404中mRNA的表达情况，评价kinectin作为肝癌抗原分子标记以及肝癌免疫治疗特异性靶位的可能性。(2)运用体外基因工程的方法表达、分离纯化kinectin—MBP重组融合蛋白、SMP-30一MBP重组融合蛋白(SMP一30为课题组前期已深入研究的另一肝癌相关抗原

2、，考虑实验室有库存蛋白，本实验顺带比较检测其杀伤效应)，探讨kinectin、SMP-30以融合蛋白形式致敏DC后，能否刺激自体T淋巴细胞转化为CTL以及CTL对BEL-7404肝癌细胞有无杀伤作用。(3)免疫组化的方法检测kinectin融合蛋白致敏的DC刺激T细胞亚群活化情况，初步探讨以DC为基础的kinectin瘤苗在肝癌的临床应用价值及其生物学机制。方法：(1)运用RT-PCR技术检测国产肝癌细胞株BEL-7404kinectin基因(D2选择剪接区)mRNA的表达，并与肝癌组织、相应癌旁

3、肝组织、正常肝组织比较，了解其表达情况。(2)运用体外蛋白重组技术表达、分离纯化kinectin—MBP融合蛋白、SMP一30—MBP融合蛋白，并与正常人外周血树突状细胞(Dendriticcell，DC)孵育；ELISA检测kinectin-MBP致敏组DC培养上清液IL-12、IFN-Y分泌量；尼龙毛柱分离自体T淋巴细胞后，以致敏DC诱导自体T淋巴细胞为细胞毒性T淋巴细胞(CTL)，MTT法检测各组T淋巴细胞增殖情况，LDH4h释放法检测CTL对BEL-7404肝癌细胞的细胞毒作用；(3)Su

4、pervision硼，HRP试剂盒免疫组化法检测kinectin—MBP孵育DC组刺激增殖的T细胞中CD4+、CD8+T细胞亚群活化情况，初步判断以DC为基础的kinectin瘤苗在肝细胞癌的生物学作用及4肝癌相关抗原KINECTIN基因的重组、表达及其致敏DC抗肝癌活性研究机制。结果：(1)kinectin(D2选择剪接区)mRNA在BEL-7404肝癌细胞株及两例肝癌组织中呈较强阳性表达，相应癌旁肝组织则呈弱阳性，一例正常肝组织未见表达。(2)运用体外重组蛋白技术成功表达、分离纯化出kinec

5、tin-MBP，SMP-30-MBP，SDS—PAGE电泳检测分子量与预期分子量相吻合。(3)DC培养、T淋巴细胞增殖、杀伤实验结果：PBMC经rhGM-CSF、rhlL-4诱导培养1周后，出现典型的DC形态；结合FCM细胞表型检测鉴定为DC；DC经Kinectin-MBP致敏后，IL-12、IFN—Y分泌量明显高于MBP孵育组和未致敏DC组(尸均

6、05)；刺激细胞(DC)占效应细胞(T细胞)比例越大，则增殖能力越强；经kinectin—MBP、SMP一30一MBP融合蛋白致敏的DC诱导的CTL对BEL-7404肝癌细胞均具有较高的杀伤率，在效靶比为25：1时杀伤率达最高峰(分别为65．oo±1．47％；64．404-1．40％)。(4)免疫组化检测结果：Kinectin-MBP蛋白致敏DC束IJ激的T细胞组CD8+T细胞明显高于MBP孵育DC束)J激的T细胞组、非致敏DC束IJ激组及普通培养T细胞组(P均

7、4／CD8值之间比较，差异无统计学意义(P值均>O．05)。结论：kinectin基因(D2选择剪接区)在BEL-7404肝癌细胞株中表达呈较强阳性，具有作为肝癌诊断的辅助分子标记、肝癌免疫治疗特异性靶位的潜在价值。体外蛋白重组技术可成功表达、分离纯化出Kinectin—MBP融合蛋白；经Kinectin-MBP、SMP-30-MBP融合蛋白致敏的DC能有效刺激自体T淋巴细胞的增殖，且可诱导T细胞转化为CTL，后者对BEL-7404肝癌细胞具有较强的细胞毒活性。考虑课至IJSMP-30的表达特点以

8、及课题组前期实验气肝癌相关抗原KINECTIN基冈的重组、表达及其致敏DC抗肝癌活性研究中文摘要结果，SMP一30在正常肝组织亦存在阳性表达，故SMP-30能否作为肝癌疫苗尚有待深入研究；但是，结合我们的实验结果，目的蛋白Kinectin-MBP作为肝癌相关抗原可通过致敏DC发挥比较明显的抗肿瘤功能，有望开发为肝癌生物治疗的新疫苗。疫苗关键词：kinectin，SMP-30，BEL-7404肝癌细胞株，DC，CTL，CD8，肝癌相关抗原kinectin基因的重组、表达及其致敏DC抗