柔嫩艾美耳球虫抗药性虫体纯化及mRNA差异显示的研究

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1、中文摘要球虫病是集约化的养鸡场危害晟火的疫病之一，目前其防治仍不能离开抗球虫药，但药物饺州过程中不可避免的会产生抗药性．因此，我们选择抗药性这个球虫病防iff中的重要课题进行研究．采_I{j玻璃纸法进行了柔嫩艾美耳球虫(Ei口eriatenella)的单卵囊感染车¨单孢子囊克隆，采川过滤、离心分离和DE．52纤维索柱层析系列方法纯化了不同虫株球虫的裂殖子，对不同虫株的裂殖子进行了mRNA差异显示，进行了实验室球虫抗药性分子检测方法的初步应用。单卵囊纯化和单孢子囊克隆。JI=}j单卵囊感染技术，对柔嫩艾荚耳球虫卵囊进行了分离纯化，实验室单卵囊感染26只鸡，饱和盐水漂

2、浮集卵法进行检测，成功率达38％；首次采用单孢子囊克隆技术，在国内对柔嫩艾美耳球虫进行了克隆，单孢子囊感染35只鸡，10只鸡感染成功，成功率28．6％。结果获得了遗传上单一的上海马杜霉素敏感和抗药虫株，甘肃地克珠利敏感和抗药的虫株，该单卵囊分离纯化和单孢子囊克隆技术简单易行。不同虫株的裂殖子的分离纯化。12日龄的肉用雏鸡，感染1．5×103个卵囊，采用标准分样筛过滤、离心分离和DEAE-52纤维素柱层析，纯化了2个敏感虫株和2个抗药虫株裂殖子，通过比较，选定离心管加样三分之二高度，600rpm离心8分钟，填充高度为14em的层折柱分离纯化，从30只鸡盲肠黏膜中纯化

3、裂殖子1．85×lO7个，平均每只鸡获得裂殖子617×10’个，其中杂质极少，其纯度适用于mRNA差异显示等分子生物学研究．分别分离纯化了柔嫩艾美耳球虫马杜霉素敏感虫株和抗药虫株5×105个裂殖子。柔嫩艾美耳球虫敏感虫株和抗药虫株的mRN^差异显示。采用锚定引物和I随机引物，首次对马杜霉素敏感虫株和马杜霉索抗药虫株进行差异显示PCR，共回收34条差异片段，反向Northern点杂交鉴定4个片段为阳性，对阳性克隆测序、同源性比较。来自于马杜霉素抗药虫株裂殖予的ACD3—2序列与柔嫩艾美耳球虫微线一5同源性达99％，说明ACD3～2序列是该基闭的部分序列，微线一5蛋白

4、与虫体融解宿主细胞膜、入侵、运动和溢出有关，在第二代裂殖子时期，抗药性虫株该序列发生转录，而在敏感虫株中沉默。HCDl序列米臼马杜霉索敏感虫株，该片段与柔嫩艾美耳球虫表面抗原16和17序列同源性分别为83％雨186％，没有该表面抗原功能的报道。AGD5片段米白抗药虫株，EA．D8—2序列来自敏感虫株。通过比较认定这两条序列为新序列，它们所代表的基lj司的意义尚不清楚。实验室球虫抗药性分子检测的初步研究。选择在敏感虫株中沉默，抗曲虫株中表达的特异序列AGD5设计检测引物，采J{}jRT-PCR方法，以总RNA反转录的eDNA为模板，RT—PCR方法能够鉴别马杜霉素抗

5、药虫株羊¨3株马杜霉素敏感虫株(2株对所有药物敏感的不同地理株t1株地克珠利抗药性虫株)：此鉴定结果与鸡体试验的结果一致。说明敏感虫株羽I抗约虫株的在该序列的筹异发生在转录水平。以卵囊的总DNA为模板PcR方法却不能鉴别敏感雨l15杜霉索抗药性虫株。关键词：柔嫩艾美耳球虫；抗药性；纯化：mRNA筹异显示。AbstractSingleoocystisolationandsinglesporneystcloningofEimeriatenellcLTheoocystsinfaecesoftheehickenswereidentifiedundermicroscopea

6、ftersaturatedsodiumchloridesolutionfloating．OocystofE．tenellawasisolatedandpudfledbythesingleoocystisolationtechnique，andtheSUCCESSratewas38％．OocystorE．tenellawasclonedbythesinglesporncystcloningtechnique，andtheSuccessratewas28．6％．Thehomogenesstrainsoffourdiferentialstrainswererespect

7、ivelygot．PurlticationofmerozoitesofEimeriatenell,,MerozoitesfromfourstrainsofEtenellawerepurifiedbyserialmethods，includingthestandardsamplesiftfilteration，centrifugalwashing，differentialvelocitycentrifugation．andDEAE-52cellulosecolumnchromatography．1．85×107merozoiteswereobtainedfrom30

8、chick