甲状腺激素受体新亚型TRβΔ的组织分布研究

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1、天津医科大学博士学位论文中文摘要甲状腺激素通过与广泛分布在各种组织中的甲状腺激素受体(thyroidhormonereceptors，TRs)结合，作用于转录过程实现其对靶基因的正性／负性调节，对于机体的正常分化发育和代谢平衡具有十分重要的作用。TRa和刀够基因产生的转录本(transcript)因选择性剪接或转录起始位置的不同而产生若干同功体(isoform)。TRJ3A是继已报告过的大鼠TRs：TRal、TRot2、TRet3、TRAol、TRAtt2、TRyl、TRy2、TR[33和TRAp3后

2、我们新发现的一种甲状腺激素受体亚型。其mRNA仅较TRill的mRNA多出了一个108bp的片段。TRJ3A蛋白亦与TR$l具有较高同源性，仅在近氨基端多出了36个氨基酸。目前尚无针对此新受体蛋白的特异性抗体，而文献报道中关于TRyl的组织分布研究尚无法区分TRBl和TR[IA两种受体。因此，本文针对此TRl3A新亚型在大鼠各组织中的分布状况进行研究。实验目的：自行制备抗TRJ3A多克隆抗体，检测成年大鼠不同组织中TRpA蛋白的表达状况。Real．timePCR检测rRBA转录本在大鼠不同组织中的含量

3、。分析刀砌、刀妒J在转录水平表达的时间、空间特异性及两者的表达相关性。方法：1．对TROA的特异片段进行生物信息学分析，以确定其含有抗原决定簇，适合作为人工抗原用于免疫过程。建立间接ELISA用以在免疫过程中监测抗血清效价并评价纯化后抗体效价。表达重组大鼠TRp△和TR[n蛋白用以进行多抗的特异性检测。2．应用RT-PCR方法检测正常成年大鼠肝、脑、肾、脾、小肠、骨组织中是否存在脚倒的表达。用Real．time实时荧光定量PCR分析硒黝、TRill及TRfl,d+TRfllmRNA在成年大鼠肝、脑、肾

4、、脾组织中的空间分布特异性，以及在幼鼠不同发育期的时间分布特异性。3．应用Westernblot方法检测成年大鼠肝、脑、肾、脾组织中TRD△蛋白的表达。结果：1．TRJ3A特有的36AA片段中含有单一抗原决定簇。纯化后的抗血清仍具有较高效价，所制备抗体可特异性地与重组大鼠TRpA蛋白发生免疫反应而不与天津医科大学博士学位论文重组大鼠TR[31蛋白发生交叉反应。2．在正常成年大鼠肝、脑、肾、脾、小肠、骨组织均检测到刀砌mRNA的表达。经对职团、TRIll及rysz+ry$1三种mRNA的定量研究发现，乃

5、黝与豫洒j在成年大鼠的肝，肾，脾组织高表达，脑组织中低表达；不同发育期大鼠肝组织的表达强度均高于其它三种组织，脑组织并未表现出类似于成年大鼠的显著低水平表达。就表达的阶段特性而言，各组织的表达峰值均处于发育期，成年后表达水平降低。在不同组织中及不同发育时段，掣的表达量均显著高于TRill，并在刀妒J+掣的和值中占相当大的比例。3．在成年大鼠肝、肾组织的核提取物中可检测到TRfJa蛋白的表达，但未能在脑、脾组织中检测到其表达。结论：1．成功制备了抗TRl3A多克隆抗体。所制备的抗体具有较高的效价及特异性

6、。2．TRflAmRNA在正常大鼠肝、脑、肾、脾、小肠、骨组织中普遍存在，并非是来源于个体基因突变的偶然现象。掣与刀妒J均与原来认为的TRill(实际上是郦J+刀黝)有着非常相似的组织分布特征，硼蚴表达具有与其它刀够亚型类似的在发育阶段高表达，成年后趋于较低水平稳定表达的特征。在大鼠组织中TRflA新亚型可能作为一种主要的剪接形式而存在。3．TRgA作为一个新的受体蛋白而存在于正常成年大鼠肝、肾组织中。关键词：甲状腺激素受体新亚型组织分布荧光定量PCRIl天津医科大学博士学位论文Abstract‘Th

7、yroidhormonehasveryimportantmetabolicanddevelopmentalregulationeffectsinalmostallorgansofthebody．Itexertsmostofmeirfunctionsatthegemomiclevel，throughbindingtothyroidhormonereceptors(TRs)，whicharehighlyconservedtranscriptionfactorsofthenuclearreceptorsup

8、erfamily．Becauseofdifferenttranscriptstartpositionandalternativesplicing,eachsubtypehasseveralisoforms，includingTRal，TRa2，TRa3，TRAal，TRAa2，TR[31，TRIB2，TRp3，TRap3．TRp△isanovelTRpisoformwhichhaveisolatedandidentifiedinratliver．It’S