甲壳素脱乙酰酶作用机理及基因表达的研究进展

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1、716中国医药工业杂志ChineseJournalofPharmaceuticals2005,36(11)甲壳素脱乙酰酶作用机理及基因表达的研究进展彭益强方柏山(华侨大学工业生物技术研究所福建泉州362021)摘要综述了甲壳素脱乙酰酶(CDA)催化甲壳素脱乙酰基的多点进攻作用机理酶法制备壳聚糖的特性以及克隆表达CDA基因的研究进展关键词甲壳素脱乙酰酶甲壳素壳聚糖综述中图分类号Q556文献标识码A文章编号1001-8255(2005)11-0716-04甲壳素(chitin)是由N-乙酰-D-氨基葡萄糖通过壳素结晶成微纤维状CDA难进入分子

2、内部故b-(14)-糖苷键联结的直链多糖是总量仅次于难以脱除乙酰基纤维素的天然均聚物其脱乙酰化产物壳聚糖CDA作用机理的研究多以壳聚多糖和甲壳寡糖(chitosan)可广泛应用于医药食品日用化工等为对象以来源于毛霉菌Mucorrouxii的CDA对水领域壳聚糖具有广谱抗菌作用[1]其脱乙酰度溶性壳聚多糖(30单位聚体)进行了约30的随机脱分子量等对其在医药食品等方面的应用有很大影乙酰反应通过1HNMR和13CNMR检测发现酶响甲壳素脱乙酰酶(chitindeacetylaseCDA)是水解乙酰基反应是多点进攻模式复合作用点有3催化甲壳素乙

3、酰基水解反应的酶和根瘤蛋白壳聚个被水解的底物应具有至少3个脱乙酰作用点寡糖脱乙酰酶乙酰木聚糖酯酶木聚糖酶等同属而CDA一次能够进行脱乙酰反应的最大位点数是于糖酯酶家族4(carbohydrateesterasefamily43[7,8]推测水解过程可能如下CDA先与1条底物CE4)[2]CDA来源广泛如真菌酵母和昆虫分子链结合然后自底物结合位置的非还原端开始等[3]不同来源的CDA在分子量最适pH温度依次水解数个乙酰基接着CDA与底物解离重新及乙酸耐受性等酶学性质方面均有差异[4]本文就与另一条底物分子结合进行新一轮的脱乙酰反应CDA在酶

4、促反应机理基因的克隆表达与纯化方面需要指出的是酶与底物分子中任一序列结合是随的研究进展作一综述机的无倾向性[8]1CDA的酶促反应作用机理来源于M.rouxii的CDA对甲壳寡糖(27单位CDA的酶促反应即水解脱除甲壳素链上的N-乙聚体)作用机理的研究也表明反应是多点进攻模式酰基制备壳聚糖研究表明CDA对不同底物作用脱乙酰后的甲壳寡糖经2种特别的外切糖苷酶作的效率不同MartinouA等[5]对比了CDA对不同甲用可用HPLC测其序列再以1HNMR进一步验证壳素底物的催化效率发现脱乙酰效率顺序如下结果发现寡糖链的长度对酶促作用有很大影响对

5、羧甲基甲壳素甲壳素的脂肪族二元醇无定型甲于少于3个聚糖单位的甲壳寡糖CDA无酶活性壳素晶态甲壳素CDA的活性一般对甲壳寡糖高对于N-乙酰壳四糖N-乙酰壳五糖CDA能完全于长链多糖对可溶性甲壳素衍生物高于结晶态甲脱除其乙酰基而N-乙酰壳三糖N-乙酰壳六糖壳素对此Kafetzopoulos等[6]解释为甲壳素和N-乙酰壳七糖的实验测定结果则表明虽然它们分子刚形成时分子间未完全键合因此CDA易也能被CDA脱除乙酰基但还原端残基仍保持完接近新生甲壳素分子的乙酰基团而起作用一旦甲整如图1所示[8]CDA最先从甲壳寡糖的非还原端开始水解乙酰收稿日期2

6、004-10-28基金项目国家自然科学基金项目(20446004)基且要求所水解的寡糖聚体的聚合单体数大于2作者简介彭益强(1973)男讲师博士研究生专业方向生物工程才有水解活力然后再水解下一个乙酰基这种作Tel0595-22690073用机制与其它酶作用于多聚体底物的作用机制也较E-mailpyqiang@hqu.edu.cn中国医药工业杂志ChineseJournalofPharmaceuticals2005,36(11)717图1来源于M.rouxii的CDA对甲壳寡糖的作用模式相近[9]高要求且无环境污染问题值得关注[12]来源于

7、植物病原体C.lindemuthianum的CDA以研究表明直接以来源于各种真菌的CDA作用甲壳寡糖为作用底物采用HPLC和FAB-MS测定于结晶态或化学修饰形式的甲壳素脱乙酰度仅为发现作用方式与来源于M.rouxii的CDA相近能完0.59.5因此有必要在加入酶前对底物进行全水解N-乙酰壳四糖的乙酰基还可以完全水解N-预处理初步实验表明来源于M.rouxii的CDA作乙酰壳三糖和N-乙酰壳二糖的非还原端残基尤为用于部分脱乙酰的水溶性壳聚糖终产物脱乙酰度重要的是在一定的条件下(3mol/L乙酸钠)此酶可达97更具意义的是来源于C.lind

8、emuthianum可以催化逆向脱乙酰反应经FAB-MS和NMR测的CDA可催化脱乙酰的逆反应如利用部分脱乙酰定证实此酶可将壳二糖乙酰化成2-乙酰氨基-2-脱的甲壳寡糖加上乙酰基合成3-乙酰基