骨髓基质细胞诱导中脑神经干细胞分化的神经元活性的研究

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1、中文摘要骨髓基质细胞诱导中脑神经干细胞分化的神经元活性的研究摘要目的：自多潜能的神经干细胞(NeuralstemcellS，NSCs)在成年小鼠纹状体分离出来后，人们便开始探索使用NSCs治疗神经系统疾病的可行性，发现体外扩增的NSCs植入脑内后，可在脑内存活、迁移和分化，更重要的是分化于NSCs的神经元能与周围神经元发生整合。因此NSCs移植正成为帕金森病等神经系统变性疾病极具有前景的治疗手段。骨髓基质细胞(BoneMarrowStromalCelIs，BMSCs)是一个多种细胞共存的多潜能干细胞，受环境因素、激素、细胞因子等的调节，可在

2、体内外分化为内皮细胞、成纤维细胞、巨噬细胞、软骨细胞、肌肉细胞、肝细胞、神经元和神经胶质细胞等。BMSCs表达多种细胞表面分子和分泌多种细胞因子、生长因子以及细胞外基质等，对造血干细胞的分化和发育起着决定性的作用。而调节造血干细胞的细胞因子和生长因子同样也可调节中枢和外周神经系统的发育，包括形态发生、神经元和胶质细胞的分化、神经递质／受体的表达、突起的生长等。更重要的是造血干细胞和NPCs可表达很多共同基因，提示造血干细胞和NPCs存在类似的发育和分化机制。所以，BMSCs也应具有调节NPCs发育和分化的能力。Kawasaki等发现BMSC

3、s可诱导小鼠和灵长类动物胚胎干细胞(ES)分化为神经干细胞NSCs，后者可分化为较高比例的神经元和一定比例的多巴胺能神经元，提示BMSCs可提供诱导ES分化中文摘要为神经细胞的信号。那么，BMSCs是否可直接调节NSCs的分化?在体外经BMSCs条件液诱导分化来的这些神经元是否同成熟神经元一样具有神经元的功能?本研究所获得的信息将有助于探讨NSCs的分化机制和推动NSCs的应用，为NSCs治疗神经系统疾病奠定了理论基础。方法：分离培养BMSCs、新生大鼠中脑NSCs，实验分为3组：1对照组(Contr01)：2BMSCs共培养组(B-CC)

4、；3BMSCs条件液组(B—CM)；Control组和B—CM组是将神经球种植于预先包被PLL的35mm的培养皿中；则是将神经球直接种于正常生长的BMSCs表面。在神经球贴壁后Control组和B—CC组将液体更换为含2％B27的Neurobasal培养液，B-CM组换成BMSCs条件液。每3d换液一次。5d后进行MAP一2免疫荧光染色，Hoechst33258复染胞核后，在倒置荧光显微镜下每孔随机选择20个不同的视野，使用CCD采样计数阳性细胞数所占的比例。在此基础上应用BMSCs--CM诱导中脑NSCs分化为神经元，免疫细胞化学染色方法

5、观察NSCs分化的神经元是否表达突触体素(synaptophysin)，以及应用荧光显微数字成像系统检测神经细胞内钙离子的改变，观察分化的神经元的电兴奋性。将三次独立实验的结果一起经SPSS统计软件处理，进行显著性分析。结果：分离培养BMSCs，BMSCs细胞的形状接近于成纤维细胞。部分细胞平行排列，使用CD71抗原进行免疫化学染色，发现细胞99％为CD71抗原阳性。分离培养NSCs培养24h后，出现2～4个细胞的细胞球。随后细胞开始聚集形成球状悬浮生长，球状的NSCs随培养天数增加逐渐增大，形成直径50～300个细胞的大小不等的NSCs球

6、。神经球内的细胞为中文摘要nestinFD性。将其贴壁进行自然分化，发现可以分化为神经元，星形胶质细胞和少突胶质细胞，用BMSCs、B—CM进行诱导，发现较自然对照组比较，在B—CC组、B-CM组，NSCs分化的神经元比例分别为(36．81±10．17％)、(37．34±8．43％)，较对照组明显增多。在此基础上利用免疫荧光探针技术，荧光显微数字成像系统对Fura-2荧光进行采集，荧光图像经过MataFlour软件进行分析，计算出平均荧光强度随时间动态变化的曲线。细胞在静状态时荧光比值维持较低水平，分别给予KCl(55mmol／L)、谷氨酸

7、(100mmol／L)后，荧光强度明显增强，细胞钙内流。在BMSCs条件液诱导中脑NSCs分化的神经元分化后3d，7d牙919d时进行突触素免疫荧光染色，未见明显的突触素表达。至12d时可见突触素表达，但荧光信号相对较弱，观察不到串珠样分布的荧光信号。至18d时，镜下可见明亮荧光信号，呈串珠状排列在神经元的突起上。结论：本研究证实：1．NSCs具有增殖的特性，自然状态下可以分化为神经元，星形胶质细胞和少突胶质细胞；2．BMSCs可以诱导NSCs分化的神经元的比例增多，星形胶质细胞比例减少；3．B—CM与BMSCs具有同样的作用，能够诱导NS

8、Cs分化的神经元的比例增多，星形胶质细胞比例减少；4．B-CM诱导NSCs分化的神经元能够在KCI和谷氨酸的刺激下打开钙通道，钙离子内流，具有电兴奋性的基础；5、BMSCs条件液